一种检测桑树品种抗寒能力的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测桑树品种抗寒能力的方法，通过特定AKR2A蛋白序列制作抗体，将拟南芥AKR2A抗体包被在96孔聚苯乙烯反应板。利用特定的桑叶组织处理后，获得AKR2A蛋白抗原，按编号加入抗体包被的反应板上，与AKR2A抗体起免疫反应，再与辣根过氧化酶标记的二抗起反应，经过底物显色以检测桑树中特异性AKR2A蛋白。通过检测桑树中AKR2A蛋白，对比分析发现桑树抗低温协迫能力的高低与AKR2A基因或蛋白含量呈正相关关系，通过桑树顶端1～2片叶片中AKR2A蛋白含量的检测指示桑树抗寒能力。本发明专利技术建立直接、快速、可靠的比较桑树抗寒能力检测方法，将其用于抗寒桑树品种的筛选、分子育种，以及桑种质(品种)的远程和超远程引种，具有巨大的学术和经济价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测桑树品种抗寒能力的方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种检测桑树品种抗寒能力的方法。
技术介绍
桑树的自然分布区域十分广阔，亚洲、北美、欧洲以及非洲都有发现桑树，桑树资源遍及热带、亚热带、温带到冷温带。由于长期生长在不同的自然环境中，形成了极其丰富的遗传多样性。有的桑树可以在降水量不足150mm的干旱半干旱荒漠区生长，有些能抗摄氏零下30℃的低温，也能忍受摄氏40℃的高温，而有些桑树对土壤酸碱度的适应性较强，在pH值4.5～8.5的条件下都能生长，土壤含盐量在0.2％时桑树也能正常生长。全球主要桑树种质资源保存地保存的桑树种质超过7000份次。迄今为止，中国已收集整理了各种类型桑种质资源3000余份，这些桑树资源保证了今后我国蚕桑产业的多元化发展需求。目前，蚕桑产业面临转型发展，桑树不仅仅可以用于养蚕，在生态环境保护方面可以发挥更大的作用。所以需要加快培育综合桑树优质性状的桑树品种，扩大优质种质资源种质范围，这对自然条件恶劣(例如寒冷)地区顺利引种也非常关键。寒冷过程中，细胞内许多酶活性被钝化，有毒害作用的活性氧(ROS)积累，引发膜脂流动性降低、膜通透性增强，膜脂过氧化作用是造成细胞伤害的直接原因(Gombosetal.,1994)。正常情况下，植物能够有效地将ROS作为信号分子，启动相应的基因表达，以清除ROS的毒害，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)等。分子伴侣是细胞中一类能识别特定肽链的非天然构象、帮助新生蛋白质实现正确折叠并维持这种折叠状态的保守蛋白质。没有分子伴侣，许多蛋白就无法定向到靶区域执行其功能。植物遭受低温伤害时，生物膜首先发生膜脂物相变化，从液晶层状变为坚硬的凝胶相。细胞的膜组织主要是脂肪酸组成的双层膜，脂肪酸分子的形状像蝌蚪，在膜上有规律地排列，其头面向膜外，尾巴藏于双层膜内。细胞受低温影响时，尾巴会非常紧密地靠近以降低膜的流动性，减少对细胞危害(VijayanandBrowse,2002)。那些“直的”脂肪酸尾巴通常由饱和脂肪酸组成，而扭曲的脂肪酸尾巴为不饱和脂肪酸组成(Becketal.,2004)。不饱和脂肪酸根据双键个数的不同，分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。单不饱和脂肪酸有油酸(C18：1)，多不饱和脂肪酸有亚油酸(C18：2)、亚麻酸(C18：3)、花生四烯酸(C20：4)、二十碳五烯酸(C20：5)、二十二碳六烯酸(C22：6)等。碳原子数超过18C的脂肪酸称为(超)长链脂肪酸。其合成是由脂肪酰-CoA延长酶催化16C/18C的脂肪酸延长产生不同链长的脂肪酸。所以18C脂肪酸是一个重要的延伸点。脂肪酰-CoA延长酶为一个多酶复合体，其中酮脂酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoAsynthase，KCS)是多酶复合体的关键性亚体。KCS1催化VLCFAs合成的第一步缩合反应，是脂肪酸延长反应的限速酶(Lassneretal.,1996)。KCS1、KCS2等在酵母中异源表达后，各种C20-C30脂肪酸的含量均有不同程度地提高，抗性增加(Trenkampetal.,2004)。而kcs1拟南芥突变体中长链脂类含量明显降低(Toddetal.,1999)。基因工程转化脂肪酸合成的酶基因，同样可以增加植物不饱和脂肪酸的合成，烟草中导入拟南芥脂肪酸去饱和酶基因Fad7，可增加转化植株中十八碳三烯脂肪酸的含量高，明显提高了其抗寒能力(Kodamaetal.,1994)。利用酵母双杂交验证拟南芥文库与AKR2A互作蛋白，发现AKR2A与KCS1有明显互作关系。AKR2A是一个保守性强的调控蛋白，与KCS1的互作关系暗示AKR2A处在长链脂肪酸合成酶KCS1的上游调控脂肪酸的合成，继而通过介导脂肪酸合成调控植物的抗寒能力。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术的不足，提供了一种通过检测桑树中AKR2A蛋白含量来检测桑树品种抗寒能力的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种检测桑树品种抗寒能力的方法，包括以下步骤：(1)抗体制作：在拟南芥TairDatabase中检索AKR2A的cDNA序列，去除N端1-198碱基，配上起始碱基ATG连接AKR2A第199碱基到终止密码的序列；以PET21为质粒，BL21为菌种生产拟南芥AKR2A目标片段蛋白质；制作拟南芥AKR2A目标片抗体；(1)抗体制作：在拟南芥TairDatabase中检索AKR2A的cDNA序列，去除N端1-198碱基，配上起始碱基ATG连接AKR2A第199碱基到终止密码的序列；以PET21为质粒，BL21为菌种生产拟南芥AKR2A目标片段蛋白质；制作拟南芥AKR2A目标片抗体；(2)抗体包被：将上述拟南芥AKR2A目标片抗体稀释，以100μL/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，获得ELISA反应的抗体基质，置于4℃备用；(3)用5％脱脂奶粉封闭抗体包被板，每孔200μL液，室温下孵育1h；(4)桑树AKR2A抗原的制备：取0.2g桑树样品在液氮冷冻状态下于研钵中研磨后，用0.2mL第一提取液振荡30s，混合均匀，冰上静置0.5h；取出后4℃下离心，将上清液移至另一试管中，沉淀物用0.2mL第二提取液悬浮得到悬浮液；将上述悬浮液煮沸10min，置于冰上冷却，4℃下离心，取上清液；将上述2次上清液合并，获得桑树AKR2A抗原；(5)将桑树AKR2A抗原与阴阳性对照，以PBST溶液1:1稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100μL，阴阳性重复两孔，22～28℃饱和湿度反应2h，洗涤备用；(6)将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG-HRP抗体，以PBST溶液1:1000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100μL，22～28℃饱和湿度避光反应2h，以PBST洗涤备用；(7)将碱性磷酸酶底物TMB，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100μL，避光反应20min，随后每个反应孔加入50μL2M浓硫酸，终止反应；(8)将终止反应的96孔聚苯乙烯反应板放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。本专利技术通过特定AKR2A蛋白序列制作抗体，将拟南芥AKR2A抗体包被在96孔聚苯乙烯反应板。利用特定的桑叶组织处理后，获得AKR2A蛋白抗原，按编号加入抗体包被的反应板上，与AKR2A抗体起免疫反应，再与辣根过氧化酶标记的二抗起反应，经过底物显色以检测桑树中特异性AKR2A蛋白。通过检测桑树中AKR2A蛋白，对比分析发现桑树抗低温协迫能力的高低与AKR2A基因或蛋白含量呈正相关关系，通过桑树顶端1～2片叶片中AKR2A蛋白含量的检测指示桑树抗寒能力。寒冷条件下，桑树叶片中AKR2A蛋白表达水平与桑树抗寒能力呈高度正相关关系。所以，只需运用ELISA的方法在苗期待检测桑树顶端1～2片叶片组织中AKR2A的表达量(即桑树中AKR2A抗原含量)，就可判断出桑树品种的抗寒能力，为通量筛选抗旱桑树种质资源、超远程桑树引种，及大面积种植时抗寒桑树品种的筛选提供了重要操作方法和理论依据。作为优选，步骤(2)中，采用pH9.6的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测桑树品种抗寒能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)抗体制作：在拟南芥Tair Database中检索AKR2A的cDNA序列，去除N端1‑198碱基，配上起始碱基ATG连接AKR2A第199碱基到终止密码的序列；以PET21为质粒，BL21为菌种生产拟南芥AKR2A目标片段蛋白质；制作拟南芥AKR2A目标片抗体；(2)抗体包被：采用pH 9.6的碳酸盐缓冲液按1:1000稀释拟南芥AKR2A目标片抗体，以100μL/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，获得ELISA反应的抗体基质，置于4℃备用；(3)用5％脱脂奶粉封闭抗体包被板，每孔200μL液，室温下孵育1h；(4)桑树AKR2A抗原的制备：取0.2g桑树样品在液氮冷冻状态下于研钵中研磨后，用0.2mL第一提取液振荡30s，混合均匀，冰上静置0.5h；取出后4℃下离心，将上清液移至另一试管中，沉淀物用0.2mL第二提取液悬浮得到悬浮液；将上述悬浮液煮沸10min，置于冰上冷却，4℃下离心，取上清液；将上述2次上清液合并，获得桑树AKR2A抗原；(5)将桑树AKR2A抗原与阴阳性对照，以PBST溶液1:1稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100μL，阴阳性重复两孔，22～28℃饱和湿度反应2h，洗涤备用；(6)将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG‑HRP抗体，以PBST溶液1:1000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100μL，22～28℃饱和湿度避光反应2h，以PBST洗涤备用；(7)将碱性磷酸酶底物TMB，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100μL，避光反应20min，随后每个反应孔加入50μL 2M浓硫酸，终止反应；(8)将终止反应的96孔聚苯乙烯反应板放入酶标仪中，读取OD650数据，判定结果。...

【技术特征摘要】
1.一种检测桑树品种抗寒能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)抗体制作：在拟南芥TairDatabase中检索AKR2A的cDNA序列，去除N端1-198碱基，配上起始碱基ATG连接AKR2A第199碱基到终止密码的序列；以PET21为质粒，BL21为菌种生产拟南芥AKR2A目标片段蛋白质；制作拟南芥AKR2A目标片抗体；(2)抗体包被：采用pH9.6的碳酸盐缓冲液按1:1000稀释拟南芥AKR2A目标片抗体，以100μL/孔的浓度包被96孔聚苯乙烯ELISA反应板，获得ELISA反应的抗体基质，置于4℃备用；(3)用5％脱脂奶粉封闭抗体包被板，每孔200μL液，室温下孵育1h；(4)桑树AKR2A抗原的制备：取0.2g桑树样品在液氮冷冻状态下于研钵中研磨后，用0.2mL第一提取液振荡30s，混合均匀，冰上静置0.5h；取出后4℃下离心，将上清液移至另一试管中，沉淀物用0.2mL第二提取液悬浮得到悬浮液；将上述悬浮液煮沸10min，置于冰上冷却，4℃下离心，取上清液；将上述2次上清液合并，获得桑树AKR2A抗原；(5)将桑树AKR2A抗原与阴阳性对照，以PBST溶液1:1稀释后，按编号加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100μL，阴阳性重复两孔，22～28℃饱和湿度反应2h，洗涤备用；(6)将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG-HRP抗体，以PBST溶液1:1000稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100μL，22～28℃饱和湿度避光反应2h，以PBST洗涤备用；(7)将碱性磷酸酶底物TMB，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100μL，避光反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈琳，张彩萍，于少芳，胡文君，裘晓云，卢红伶，沈国新，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，天台县特产技术推广站，
类型：发明
国别省市：浙江,33