一种生防菌剂及其在防治灰霉病中的应用制造技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，公开了一种生防菌剂，其包括丝孢酵母、康氏木霉以及施氏假单胞菌。本发明专利技术生防菌剂可有效抑制番茄灰霉病病原菌的生长，环保无污染，不会产生抗性，有利于作物的无公害生产。

A biocontrol agent and its application in controlling Botrytis cinerea

The invention belongs to the field of microorganism technology, and discloses a biocontrol agent, which comprises a Saccharomyces cerevisiae, Trichoderma Kang's and Pseudomonas scherkii. The biocontrol agent can effectively inhibit the growth of tomato gray mold pathogen, environmental protection, pollution-free, no resistance, and is conducive to the pollution-free production of crops.

【技术实现步骤摘要】
一种生防菌剂及其在防治灰霉病中的应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种生防菌剂及其在防治灰霉病中的应用。
技术介绍
灰霉病是露地、保护地作物常见且比较难防治的一种真菌性病害，属低温高湿型病害，病原菌生长温度为20～30℃，温度20～25℃、湿度持续90%以上时为病害高发期。灰霉病由灰葡萄孢菌侵染所致，属真菌病害，花、果、叶、茎均可发病。果实染病，青果受害重，残留的柱头或花瓣多先被侵染，后向果实扩展，致使果皮呈灰白色，并生有厚厚的灰色霉层，呈水腐状，叶片发病从叶尖开始，沿叶脉间成“V”形向内扩展，灰褐色，边有深浅相间的纹状线，病键交界分明。该病害是一种典型的气传病害，可随空气、水流以及农事作业传播。在实际病害防治过程中，难以采取有效措施彻底切断传染源；在病原菌侵入的情况下，也难以彻底消灭病原菌，如药剂喷施，难以解决空气及露水中的病原菌；而单独熏棚，不能重点解决病叶、病果等病残体上或内部的病原菌。灰霉病病苗色浅，叶片、叶柄发病呈灰白色，水渍状，组织软化至腐烂，高湿时表面生有灰霉。幼茎多在叶柄基部出现不规则水浸斑，很快变软腐烂，缢缩或折倒，最后病苗腐烂枯萎病死。防治方法可分为农业防治、化学防治和生物防治。农药防治包括对种子进行灭菌处理、合理种植密度、控制合适湿度以及通风等；化学防治目前应用比较广泛，对灰霉病的主要防治措施是喷洒化学药剂等手段，但是由于长期的使用化学药使得灰霉病菌对多种杀菌剂产生了抗药性。我国多地区的田间和保护地栽培设施中的多种蔬菜上的灰霉病菌都产生了较为严重的抗药性，甚至有些地区的灰霉病对多菌灵等杀菌剂的抗性达到80％以上。寻求新的防治措施成为灰霉病防治的重中之重。生物防治措施作为一种新兴的防治措施，与其他方法相比，具有安全、有效、持久的特点，特别是避免了化学防治带来的一系列问题。生物防治方法是采用微生物对灰霉进行杀灭，目前已经开始在农业上推广使用，比较常见的的是于发病前或初期使用3亿CFU/克哈茨木霉菌300喷雾，兑水喷雾，每隔5-7天喷施一次，可在一定程度上防治灰霉病的发生。生物防治对病害防治效果好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；对病虫害的杀伤特异性强，不伤害天敌，有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分为天然产物易降解，可回归大自然，保证可持续发展。因此生物防治灰霉病方法逐渐成为研究的热点，大量的拮抗微生物被筛选出来加以利用来对灰霉病进行防治。单一菌株往往存在防治效果低下、药效慢等缺陷，目前已经有多个生物农药公司开始研究复合微生物制剂。复合微生物制剂一般是指包括两种以上的微生物的制剂，选择复合微生物制剂中的菌株较为关键，也是难点；如果选择不慎，菌株之间反而会起到相互拮抗的反作用。
技术实现思路
为了克服现有技术复合微生物制剂种类少，菌株配伍难等缺陷，本专利技术提供了一种生防菌剂及其在防治灰霉病中的应用。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种生防菌剂，其包括丝孢酵母、康氏木霉以及施氏假单胞菌。具体地，所述生防菌剂按照如下工艺制备而得：1）将丝孢酵母划线接种在YPDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到YPD液体培养基上培养，30℃培养24h，得到丝孢酵母种子液，待用；2）将康氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基上培养，30℃、200rpm摇床培养36h，得到康氏木霉种子液，待用；3）先将康氏木霉种子液按照10-15%的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养6小时，然后将丝孢酵母种子液按照5-7%的接种量接入到发酵培养基，继续以30℃培养18小时，得到康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液；4）将施氏假单胞菌在LB平板上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落分别接入LB液体培养基上培养，28℃，200r/min的摇床培养24h，制成种子液；然后按照10%的接种量接入到扩大培养基中，28℃培养24h，得到施氏假单胞菌培养液；5）将康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液和施氏假单胞菌培养液按照2-3:1-2的体积比混合均匀，然后真空冷冻干燥制得菌粉，即得。进一步地，所述施氏假单胞菌优选ATCC17588；所述康氏木霉优选ATCC66766；所述丝孢酵母优选ATCC201110。优选地，所述YPD培养基的配方为：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，补充蒸馏水至1000mL。优选地，所述YPDA培养基的配方为：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，琼脂20g,补充蒸馏水至1000mL。优选地，所述发酵培养基的配方为：玉米秸秆粉16g/L、豆粕10g/L、氯化铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.01g/L。优选地，所述扩大培养基的配方为：玉米淀粉12g/L、酵母提取物10g/L、氯化钠5g/L、尿素2g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L。与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：丝孢酵母和康氏木霉之间无拮抗作用，可以相互共生，木霉菌能够分泌纤维素酶，将秸秆纤维素分解为丝孢酵母可利用的碳源，从而使得丝孢酵母能够利用农业废弃物作为碳源进行生长，所以采用先接入康氏木霉的方式，6小时后接入酵母菌；酵母菌反过来还能促进康氏木霉的生长，并且使得木霉的产酶量也大大提高，从而提高拮抗灰霉菌的能力；施氏假单胞菌能够分泌抗菌物质能够分泌多种活性酶和植物刺激素，促进植株根系以及植株生长，增强抗逆性，使得植物对灰霉病产生拮抗作用，还能够通过营养与空间的竞争来抑制灰霉病；专利技术人在试验中发现，施氏假单胞菌与丝孢酵母菌-康氏木霉具备较好的协同作用，能够大大提高杀灭灰霉病的能力，可能原因在于它们之间具有类似于共生的关系，施氏假单胞菌的代谢物为丝孢酵母菌的繁殖提供了一些必要的促生长因子，从而促进快速繁殖并产生大量拮抗物质，然后通过这类物质的作用而导致灰霉菌不能正常生长；具体的作用机理，专利技术人会在后续的试验中做进一步的深入研究。此外，本试验只是针对灰霉菌的拮抗进行了研究，至于对其它土传致病菌病害的防治效果也有待于进一步研究。本专利技术属于生防微生物制剂，完全没有化学防治所带来的一系列问题，因而有利于作物的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治灰霉病以及提高抗逆性和促生的措施，这不仅可为农民种植减轻负担，而且有利于作物的出口，提高产品品质，增加产品附加值。同时，生防制剂还具有对作物增产功效，可为农民增加收入。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。实施例1一种生防菌剂，其包括丝孢酵母、康氏木霉以及施氏假单胞菌。具体地，所述生防菌剂按照如下工艺制备而得：将丝孢酵母划线接种在YPDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到YPD液体培养基上培养，30℃培养24h，得到种子液，待用；YPD培养基的配方：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，补充蒸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生防菌剂，其包括丝孢酵母、康氏木霉以及施氏假单胞菌。

【技术特征摘要】
1.一种生防菌剂，其包括丝孢酵母、康氏木霉以及施氏假单胞菌。2.根据权利要求1所述的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂按照如下工艺制备而得：1）将丝孢酵母划线接种在YPDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到YPD液体培养基上培养，30℃培养24h，得到丝孢酵母种子液，待用；2）将康氏木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基上培养，30℃、200rpm摇床培养36h，得到康氏木霉种子液，待用；3）先将康氏木霉种子液按照10-15%的接种量接入到发酵培养基中，30℃培养6小时，然后将丝孢酵母种子液按照5-7%的接种量接入到发酵培养基，继续以30℃培养18小时，得到康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液；4）将施氏假单胞菌在LB平板上划线培养，得到单菌落；挑取单菌落分别接入LB液体培养基上培养，28℃，200r/min的摇床培养24h，制成种子液；然后按照10%的接种量接入到扩大培养基中，28℃培养24h，得到施氏假单胞菌培养液；5）将康氏木霉-丝孢酵母混合发酵液和施氏假单胞菌培养液按照2-3:1-2的体积比混合均匀，然...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶志坚，齐晔，周竞夫，朱锡杭，朱增湖，
申请(专利权)人：叶志坚，
类型：发明
国别省市：浙江,33