一种黑腹果蝇Ras制造技术

本发明专利技术公开一种黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型的建立方法，采用特定的果蝇品系进行杂交后培养并筛选获得黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型；本发明专利技术方法构建的黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型，研究者可利用此模型进行大规模的遗传筛选，寻找抑制肿瘤迁移的基因突变或RNAi，阐明其调控肿瘤迁移的分子机制，并在哺乳动物细胞中对其同源物进行功能验证，以期为癌症的临床治疗提供新的药物靶点和治疗方案。

A kind of Drosophila melanogaster Ras

The invention discloses a method of setting up a RasV12 and Snail tumor migration model of Drosophila melanogaster, using specific Drosophila strain to cross culture and screening the migration model of RasV12; Snail tumor of Drosophila melanogaster; the RasV12; Snail tumor migration model of Drosophila melanogaster, which is constructed by the invention method, and the researchers can use this model for big rules. Genetic screening of the model, searching for gene mutation or RNAi to inhibit tumor migration, clarifies the molecular mechanism of regulating tumor migration, and performs functional verification of its homologues in mammalian cells, in order to provide new drug targets and treatment options for the clinical treatment of cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型的建立方法
本专利技术属于生物遗传学
，具体涉及一种黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型的建立方法。
技术介绍
果蝇遗传学操作系统，有Gal4/UAS双表达系统和FLP/FRT系统。其中，（一）Gal4/UAS双表达系统：Gal4/UAS系统是果蝇中最为常用的转基因技术体系，可以让外源基因或RNAi在特定细胞或组织选择性表达。半乳糖调节上游启动子元件（galactose-regulatedupstreampromoterelement4），缩写Gal4，是酵母中类似于原核生物乳糖操纵子的一个转录激活子。上游激活序列UAS（upstreamactivatesequense），是酵母中另一种类似高等真核生物增强子的序列。Gal4通过与UAS相结合，调节与半乳糖代谢相关基因的表达。1993年，科学家将目的基因X连接在UAS之后，通过转基因技术建立UAS-X果蝇品系，然后与特定的Gal4果蝇品系杂交，在后代中就可以得到同时具有Y-Gal4和UAS-X的果蝇，从而实现特异性的在Y组织表达X基因（参考文献1，BrandA.H.andPerrimonN.,Targetedgeneexpressionasameansofalteringcellfatesandgeneratingdominantphenotypes.Development,1993,118:401-15）。因为果蝇基因组不编码Gal4转录因子，所以在果蝇体内过量表达Gal4，不会对果蝇的发育产生显著的影响。同样，在果蝇体内插入UAS调控序列，也不会对果蝇产生影响。这个系统的建立为利用果蝇作为研究模型的科学家在实验设计上提供了有利、便捷、高效的遗传操作工具。Gal4/UAS双表达系统示意图如图1所示。（二）FLP/FRT系统：FLP是酵母中的一种重组酶，它可以识别两个700bp的同源靶位点FRT(FLPrecombinationtargets，FRTs)，如果两个FRT片段位于果蝇一对同源染色体的相同位点，热击诱导的FLP表达可以介导这两个位点进行有丝分裂重组，产生重组远端纯合的子细胞(图2)（参考文献2，ZhangS.P.andXueL.,[ProgressoncelllineageanalysisinDrosophilamelanogaster].YiChuan,2012,34:819-28）。研究发现FRT介导的有丝分裂重组效率远高于其他方式，重组发生的位点也可以人为控制。此外，热击对细胞的伤害也较小。因此，研究者可以通过FLP/FRT技术探究少量基因改变的细胞在野生型细胞环境下的生长情况，从而进一步研究细胞竞争的分子机制。FLP/FRT系统作用原理示意图如图2所示。果蝇作为研究人类疾病的模式生物,与哺乳动物不仅在基本的生物学、生理学和神经系统机能等方面比较相似,而且果蝇有其作为模式生物的独特优势。近年来的研究表明,果蝇和人类在肿瘤发生信号通路等方面的保守性很高,而且果蝇具有很强的遗传学可操作性,是肿瘤学研究有效的模型之一,可用于研究人类肿瘤发生、发展、转移等分子机制。近年来研究人员已经建立了很多用于研究特定癌症的果蝇模型，但是新的特定癌症的果蝇模型的建立对阐明肿瘤发生的分子机制起到重要作用，将会为更多癌症的临床治疗提供新的药物靶点和治疗方案。因此，建立新的特定肿瘤的果蝇模型是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型的建立方法及其应用。本专利技术的另一目的在于提供上述方法建立的黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型的建立方法，采用特定的果蝇品系进行杂交后培养并筛选获得黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型；具体包括以下步骤：（1）将UAS-Snail74b果蝇品系和Sp/Cyo;Sb/TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Snail74b/Sp;+/Sb雄性果蝇；同时将Sp/Cyo;Sb/TM6B.Tb果蝇品系和UAS-RasV12果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为+/Cyo;UAS-RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇；然后将获得的UAS-Snail74b/Sp;+/Sb雄性果蝇和+/Cyo;UAS-RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Snail74b/Cyo;UAS-RasV12/Sb雄性果蝇；接下来，将得到的UAS-Snail74b/Cyo;UAS-RasV12/Sb雄性果蝇和基因型为Sp;Sb/SM6B-TM6B.Tb品系的雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Snail74b;UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb果蝇，雌雄适量，建成Stock品系；（2）将ey-Flpact>y+>Gal4UAS-GFP（简写为ey-Flp,GFP）果蝇品系和步骤（1）中最终获得的UAS-Snail74b;UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为ey-Flp,GFP/UAS-Snail74b;UAS-RasV12/+的三龄幼虫，表型为有GFP、体型非短粗，即为黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型。步骤（1）中UAS-Snail74b果蝇品系和Sp/Cyo;Sb/TM6B.Tb果蝇品系进行杂交时亲本雌雄任意组合均可；Sp/Cyo;Sb/TM6B.Tb果蝇品系和UAS-RasV12果蝇品系进行杂交时亲本雌雄任意组合均可；步骤（2）中ey-Flpact>y+>Gal4UAS-GFP果蝇品系和步骤（1）中最终获得的UAS-Snail74b;UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb果蝇品系进行杂交时亲本雌雄任意组合均可。所述培养过程中所用的培养基的配方为红糖135g，琼脂7g，玉米粉85g，酵母8g，丙酸4ml和水1000ml。所述培养的条件为：温度20~30℃恒温（优选为25℃），湿度50%-60%。将果蝇品系进行杂交的过程为：将果蝇麻醉后，在通有CO2的平板上进行挑选雌雄、杂交和观察表型的操作；做杂交实验前必需收集未交配过的处女蝇；所述处女蝇选取方法为将原种瓶中的成虫全部清除，此后每隔8小时收集刚羽化的雌果蝇即为处女蝇。上述的方法在构建黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型中的应用。上述的方法构建的黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型。本专利技术的有益效果：本专利技术方法构建的黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型，研究者可利用此模型进行大规模的遗传筛选，寻找抑制肿瘤迁移的基因突变或RNAi，阐明其调控肿瘤迁移的分子机制，并在哺乳动物细胞中对其同源物进行功能验证，以期为癌症的临床治疗提供新的药物靶点和治疗方案。附图说明图1为Gal4/UAS双表达系统示意图。图2为FLP/FRT系统作用原理示意图。图3为果蝇雌雄辨别示意图。图4为果蝇杂交流程示意图。图5为上调Snail促进肿瘤生长及RasV12细胞的迁徙。其中图A-D为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型的建立方法，其特征在于：采用特定的果蝇品系进行杂交后培养并筛选获得黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型；具体包括以下步骤：（1）将UAS‑Snail74b果蝇品系和Sp/Cyo;Sb/TM6B.Tb 果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为UAS‑Snail74b/Sp;+/Sb 雄性果蝇；同时将Sp/Cyo;Sb/TM6B.Tb 果蝇品系和UAS‑RasV12果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为+/Cyo;UAS‑RasV12/TM6B.Tb 雌性果蝇；然后将获得的UAS‑Snail74b/Sp;+/Sb 雄性果蝇和+/Cyo;UAS‑RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS‑Snail74b/Cyo;UAS‑RasV12/Sb 雄性果蝇；接下来，将得到的UAS‑Snail74b/Cyo;UAS‑RasV12/Sb 雄性果蝇和基因型为Sp;Sb/SM6B‑TM6B.Tb 品系的雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS‑Snail74b;UAS‑RasV12/SM6B‑TM6B.Tb果蝇，雌雄适量，建成Stock品系；（2）将ey‑Flp act>y+>Gal4 UAS‑GFP（简写为ey‑Flp, GFP）果蝇品系和步骤（1）中最终获得的UAS‑Snail74b;UAS‑RasV12/SM6B‑TM6B.Tb 果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为ey‑Flp, GFP/UAS‑Snail74b;UAS‑RasV12/+的三龄幼虫，表型为有GFP、体型非短粗，即为黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型。...

【技术特征摘要】
1.一种黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型的建立方法，其特征在于：采用特定的果蝇品系进行杂交后培养并筛选获得黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型；具体包括以下步骤：（1）将UAS-Snail74b果蝇品系和Sp/Cyo;Sb/TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Snail74b/Sp;+/Sb雄性果蝇；同时将Sp/Cyo;Sb/TM6B.Tb果蝇品系和UAS-RasV12果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为+/Cyo;UAS-RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇；然后将获得的UAS-Snail74b/Sp;+/Sb雄性果蝇和+/Cyo;UAS-RasV12/TM6B.Tb雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Snail74b/Cyo;UAS-RasV12/Sb雄性果蝇；接下来，将得到的UAS-Snail74b/Cyo;UAS-RasV12/Sb雄性果蝇和基因型为Sp;Sb/SM6B-TM6B.Tb品系的雌性果蝇进行杂交，在后代中选取基因型为UAS-Snail74b;UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb果蝇，雌雄适量，建成Stock品系；（2）将ey-Flpact>y+>Gal4UAS-GFP（简写为ey-Flp,GFP）果蝇品系和步骤（1）中最终获得的UAS-Snail74b;UAS-RasV12/SM6B-TM6B.Tb果蝇品系进行杂交，在后代中选取基因型为ey-Flp,GFP/UAS-Snail74b;UAS-RasV12/+的三龄幼虫，表型为有GFP、体型非短粗，即为黑腹果蝇RasV12;Snail肿瘤迁徙模型。2.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晨曦，江春花，高秀娟，喇孝瑾，白素芬，
申请(专利权)人：华北理工大学，
类型：发明
国别省市：河北,13