基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法技术

本发明专利技术属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法。该方法为以自组装金电极为载体，在其表面负载羧基化氧化石墨烯、酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。石墨烯的负载增大了电信号，增加了传感器的灵敏度和稳定性。本发明专利技术利用自组装技术和静电吸附减小酶的失活，使得酸性磷酸酯酶生物传感器的稳定性与重现性好，增加了酸性磷酸酯酶生物传感器的寿命。

Construction method of acid phosphatase biosensor based on sulfhydryl functionalized graphene self-assembly

The invention belongs to the field of biosensor technology, in particular to a method for the construction of an acid phosphatase biosensor based on the self assembly of mercapto functionalized Silene. This method is an acid phosphatase biosensor based on the self assembly of mercapto functionalized graphene and acid phosphatase on the surface of a self assembled gold electrode supported on the surface of a gold electrode. The load of graphene increases the electrical signal and increases the sensitivity and stability of the sensor. The invention uses self-assembly technology and electrostatic adsorption to reduce the inactivation of the enzyme, which makes the stability and reproducibility of the acid phosphatase biosensor, and increases the life of the acid phosphatase biosensor.

【技术实现步骤摘要】
基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法
本专利技术属于生物传感器
，具体涉及一种基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法。
技术介绍
酶是人们体内一种非常重要的物质，酶可以催化反应，降低反应所需的活化能，加快反应速率。酶还具有以下特点：高专一性、可调节性、高效率、高不稳定性。例如：胰蛋白酶是由胰腺分泌的，它主要是起消化作用，分解蛋白质，利于小肠的吸收，此外，如果胰蛋白酶的活性升高或降低可以导致人们身体不适。再如，酸性磷酸酯酶(ACP)是一种水解酶，它可以将人们体内的物质水解，促进体内物质的代谢。ACP存在于肾、肝等部位，当这些部位发生病变时，体内的ACP会升高。石墨烯具有优良的导电性，是制备生物传感器的一种理想的电极材料。它可以加快电子的运动速率，使传感器的检测性增强，反应速度更快，可以改善传感器的灵敏度等性能。中国专利103743797A公开一种利用石墨烯组装多层生物酶传感器提高检测性能的新方法，以期利用一种带有大π环端基的试剂芘丁酸，通过与生物酶(以葡萄糖氧化酶为例)表面的氨基基团的酰胺化反应，对其进行改造，得到表面具有大π环端基的葡萄糖氧化酶。改造后的葡萄糖氧化酶利用石墨烯通过层层组装的方法固定在电极的表面，制备出层数可控、灵敏度高的生物酶传感器。通过π-π叠加作用将改性酶与石墨烯进行层层组装，从而解决了层数可控、结构有序、性能稳定的生物传感器组装问题，能大大提高此生物酶传感器的检测灵敏度和检测范围。该专利中的石墨烯的作用是与改性酶通过π-π叠加作用形成生物传感器。目前还未发现由氧化石墨烯与酸性磷酸酯酶共同制备生物传感器的有关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法，得到的酸性磷酸酯酶生物传感器的稳定性与重现性好，寿命长。本专利技术所述的基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法：以自组装金电极为载体，在其表面负载羧基化氧化石墨烯、酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。优选地，将金电极通过自组装L-半胱氨酸得到自组装金电极，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液初次活化后，再在其表面负载羧基化氧化石墨烯，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液再次活化后，最后修饰酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器，包括以下步骤：(1)制备自组装金电极将金电极置于铁氰化钾溶液中，利用循环伏安法扫描至稳定，之后浸泡于L-半胱氨酸溶液中，得到自组装金电极；(2)制备羧基化氧化石墨烯在浓硫酸中依次加入石墨粉、硝酸钾、高锰酸钾，升温反应，反应完毕再加入双氧水反应，得到氧化石墨烯；氧化石墨烯与氢氧化钠、溴乙酸反应，得到羧基化氧化石墨烯；(3)制备基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器步骤(1)自组装金电极经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液初次活化后，将羧基化氧化石墨烯负载到初次活化后的自组装金电极上，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液再次活化后，再将酸性磷酸酯酶修饰到再次活化后的自组装金电极上，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。其中：步骤(1)中，采用平均粒度为0.05μm的氧化铝粉对金电极抛光；步骤(1)中，铁氰化钾溶液的浓度为2.5×10-5mol/L，铁氰化钾溶液中含有氯化钾，氯化钾的浓度为10mmol/L；步骤(1)中，L-半胱氨酸溶液的浓度为1×10-3mol/L；步骤(1)中，浸泡温度3-5℃，浸泡时间为10-15h。步骤(2)中，石墨粉、硝酸钾、高锰酸钾、浓硫酸、双氧水的用量比为1-2:1-2:5-6:20-25:4-6，其中石墨粉、硝酸钾、高锰酸钾以g计，浓硫酸、双氧水以ml计；步骤(2)中，氧化石墨烯、氢氧化钠、溴乙酸的质量比为0.1-0.3:5-7:4-6；步骤(2)中，采用3-7wt.％的氯化氢溶液洗涤至中性，得到氧化石墨烯。步骤(3)中，自组装金电极经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液初次活化后，将羧基化氧化石墨烯溶液滴加到初次活化后的自组装金电极上，晾干，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液再次活化后，再将酸性磷酸酯酶溶液滴加到再次活化后的自组装金电极上，晾干，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。步骤(3)中，羧基化氧化石墨烯与L-半胱氨酸的摩尔比为1:1-1.2。步骤(3)中，酸性磷酸酯酶溶液的浓度为3-4mg/ml。步骤(3)中，初次活化时间为20-30min；再次活化时间为15-30min。本专利技术通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液对电极进行活化，并且利用静电吸附减小酶的失活。EDC/NHS溶液中，EDC与NHS的质量比为本领域技术人员的常规选择，本专利技术优选质量比为1:1。本专利技术首先将L-半胱氨酸修饰到金电极上，得到自组装金电极，然后在自组装金电极上负载羧基化氧化石墨烯与酸性磷酸酯酶，最终得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。其反应过程如下：本专利技术的Au与L-半胱氨酸的-SH结合后，生成Au—S—L-Cys—NH2，Au—S—L-Cys—NH2的氨基与羧基化氧化石墨烯的一个羧基反应生成Au—S—L-Cys—NHOC—CGO—COOH，羧基化氧化石墨烯的另一个羧基再与ACP上的氨基反应，得到Au—S—L-Cys—NHOC—CGO—COHN—ACP，即本专利技术的基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。本专利技术的有益效果如下：本专利技术以自组装金电极为载体，在其表面负载羧基化氧化石墨烯、酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。石墨烯的负载增大了电信号，增加了酸性磷酸酯酶生物传感器的灵敏度和稳定性。本专利技术利用自组装技术和静电吸附减小酶的失活，使得酸性磷酸酯酶生物传感器的稳定性与重现性好，增加了酸性磷酸酯酶生物传感器的寿命。附图说明图1是金电极、自组装金电极、酸性磷酸酯酶生物传感器的循环伏安扫描图；其中：a：酸性磷酸酯酶生物传感器；b：自组装金电极；c：金电极；图2是pH值对酸性磷酸酯酶生物传感器的影响图；图3是温度对酸性磷酸酯酶生物传感器的影响图；图4是酸性磷酸酯酶生物传感器的动力学性能图。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术做进一步描述。实施例1(1)制备自组装金电极将直径为1mm的金电极用0.05μmAl2O3粉抛光至镜面，用蒸馏水冲净，然后放到乙醇和水配制的溶液中，在超声波中清洗15min，取出自然晾干，在2.5×10-5mol/L的铁氰化钾溶液(含10mmol/LKCl)中，利用循环伏安法扫描至稳定，电位差控制在100mv内，接近64mv时效果最好。再将金电极浸泡在1×10-3mol/L的L-半胱氨酸溶液中，在4℃冰箱中浸泡自组装12h，得到自组装金电极。(2)制备羧基化氧化石墨烯先称取2.0000g石墨粉、1.0000g硝酸钾和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法，其特征在于：以自组装金电极为载体，在其表面负载羧基化氧化石墨烯、酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。

【技术特征摘要】
1.一种基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法，其特征在于：以自组装金电极为载体，在其表面负载羧基化氧化石墨烯、酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。2.根据权利要求1所述的基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法，其特征在于：将金电极通过自组装L-半胱氨酸得到自组装金电极，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液初次活化后，再在其表面负载羧基化氧化石墨烯，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液再次活化后，最后修饰酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。3.根据权利要求1所述的基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备自组装金电极将金电极置于铁氰化钾溶液中，利用循环伏安法扫描至稳定，之后浸泡于L-半胱氨酸溶液中，得到自组装金电极；(2)制备羧基化氧化石墨烯在浓硫酸中依次加入石墨粉、硝酸钾、高锰酸钾，升温反应，反应完毕再加入双氧水反应，得到氧化石墨烯；氧化石墨烯与氢氧化钠、溴乙酸反应，得到羧基化氧化石墨烯；(3)制备基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器步骤(1)自组装金电极经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液初次活化后，将羧基化氧化石墨烯负载到初次活化后的自组装金电极上，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液再次活化后，再将酸性磷酸酯酶修饰到再次活化后的自组装金电极上，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。4.根据权利要求3所述的基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，采用平均粒度为0.05μm的氧化铝粉对金电极抛光；步骤(1)中，铁氰化钾溶液的浓度为2.5×10-5mol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：高先娟，张平平，张玉军，王保玉，李霞，
申请(专利权)人：齐鲁医药学院，
类型：发明
国别省市：山东,37