改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫-碘复合物的脱色的革兰氏染色方法技术

本申请涉及改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫‑碘复合物的脱色的革兰氏染色方法。本文中提供将生物材料染色以用于检测，且在一些例子中还鉴定微生物的目的的方法。使用慢作用脱色制剂，如一种包含1,2‑丙二醇或乙二醇的脱色制剂来对细菌革兰氏染色的方法可用于延长脱色步骤的时间，如此允许革兰氏染色方法的自动化。还提供用于在显微镜载玻片上实施自动化革兰氏染色的组合物和试剂盒。

A modified Gram staining method for the decolorization of the crystal violet iodine complex of gram negative bacteria has been improved.

This application involves the improvement of the Gram staining method for the decolorization of the crystal violet iodine complex of gram negative bacteria. This article provides methods for staining biomaterials for testing, and in some cases the purpose of identifying microorganisms. The use of slow acting decolorization, such as a decolorizing agent containing 1,2 propylene glycol or glycol, can be used to prolong the time of the decolorization step, so that the automation of the Gram staining method is allowed. Compositions and kits for automated Gram staining on microscope slides are also provided.

【技术实现步骤摘要】
改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫-碘复合物的脱色的革兰氏染色方法本申请是申请日为2013年2月22日、中国申请号为201380020183.7、专利技术名称为“改进了对革兰氏阴性细菌的结晶紫-碘复合物的脱色的革兰氏染色方法”的专利技术申请的分案申请。
本公开涉及，为了检测微生物以及在一些例子中鉴定微生物的目的，而对生物材料进行染色的方法。更具体地，本公开涉及用于在显微镜载玻片上实施自动化革兰氏染色的方法、组合物和试剂盒。背景革兰氏染色是一种公知的、普遍使用的微生物学技术，其用于微生物尤其是细菌的检测、分类和鉴定。革兰氏染色的最常见方法涉及四个步骤：染色、捕获、脱色和复染色。组织学实验室中常用的革兰氏染色已知是不稳定的，特别是由于脱色步骤中的波动所致。影响脱色步骤的变量包括溶剂强度、浓度、体积和暴露持续时间。在手动革兰氏染色过程中，脱色步骤常规使用醇或丙酮，且该步骤仅需数秒。然而，对于自动化染色过程，该脱色过程发生得太快。本公开针对在自动化染色平台上的革兰氏染剂脱色的问题。概述本文中提供了能自动进行革兰氏染色的方法、组合物和试剂盒。专利技术人已鉴定出延长革兰氏染色脱色步骤的组合物，其允许革兰氏染色的自动化，例如，使用自动化的和/或计算机执行的染色装备来实现自动化。本文中提供了对样品(如在显微镜载玻片上的样品)进行革兰氏染色的方法。所述方法可用于检测和区分革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。在一些例子中，所公开的革兰氏染色方法被用于检测并非细菌的微生物，如酵母(例如假丝酵母(Candida)和隐球酵母(Cryptococcus))。在具体的例子中，所述方法包括使样品与慢作用脱色制剂(如一种包含1,2-丙二醇或乙二醇的制剂)在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌显著除去初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触。所述样品是先前与初级染剂(如结晶紫)和捕获剂(如碘)接触过的样品。在具体的例子中，所述方法包括革兰氏染色过程的一个或多个另外的步骤，如使所述样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁和细胞膜染色的条件下接触；使所述样品与捕获剂在足以形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触；使所述样品与复染剂在足以对已脱色的革兰氏阴性细菌进行染色的条件下接触，或其组合。本文还提供能充当慢作用脱色制剂的组合物。在一个例子中，所述组合物包含至少80％的慢作用脱色剂(如1,2-丙二醇或乙二醇)和不超过20％的快作用脱色剂(如0.1-20％的快速作用脱色剂，例如乙醇或丙酮)。这类组合物可用作自动化革兰氏染色中的慢作用脱色制剂。本文还提供用于自动化革兰氏染色的试剂盒。在一个例子中，所述试剂盒在容器中包含慢作用脱色制剂，如包含至少80％或至少90％的慢作用脱色剂(如1,2-丙二醇或乙二醇)和不超过20％的快作用脱色剂(如0.1-20％或1-10％的快速作用脱色剂，例如乙醇或丙酮)的制剂。在一些例子中，试剂盒可另外包含其他组分，如在容器中的一种或多种初级染剂；在容器中的捕获剂；在容器中的复染剂，显微镜载玻片，盖玻片，其他染剂，和对照载玻片。在具体的例子中，所述容器配置为与自动化革兰氏染色平台一起使用。本专利技术涉及下述技术方案。1.一种对样品进行革兰氏染色的方法，包括：使所述样品与慢作用脱色制剂在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌除去初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触，其中所述样品事先已与初级染剂和捕获剂接触过。2.技术方案1的方法，进一步包括：使所述样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁染色的条件下接触；使所述样品与捕获剂在足以形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触；使所述样品与复染剂在足以将脱过色的革兰氏阴性细菌染色的条件下接触；或其组合。3.技术方案2的方法，其中复染色在脱色的至少30秒后进行。4.技术方案1的方法，其中使所述样品与所述慢作用脱色制剂接触达至少30秒。5.技术方案1-4中任一项的方法，进一步包括将所述样品加载到自动染色装置中。6.技术方案1-5中任一项的方法，其中使用压缩空气完成所述样品与慢作用脱色制剂的接触。7.技术方案1-6中任一项的方法，其中所述慢作用脱色制剂包含慢作用脱色剂和快作用脱色剂。8.技术方案1-7中任一项的方法，其中所述脱色制剂包含至少80％的所述慢作用脱色剂和不超过20％的所述快作用脱色剂。9.技术方案1-8中任一项的方法，其中所述慢作用脱色制剂包含1,2-丙二醇或乙二醇。10.技术方案1-9中任一项的方法，其中从已知或怀疑有细菌感染的受试者获得所述样品。11.技术方案1-9中任一项的方法，其中所述样品是环境样品或食物样品。12.技术方案1-11中任一项的方法，其中已经、同时或将要对所述样品在相同或分开的载玻片上进行一种或多种另外的测定法。13.技术方案12的方法，其中使所述样品与针对特定细菌的一种或多种抗体接触、与另一种染剂接触、或其组合接触。14.技术方案1-13中任一项的方法，其中通过自动化染色装备实施所述方法。15.技术方案14的方法，其中所述自动化染色装备是VentanaNexESSpecialStainer或VentanaBenchMarkSpecialStainer。16.技术方案1-15中任一项的方法，其中所述方法进一步包括检测革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。17.技术方案1-16中任一项的方法，其中所述方法是计算机执行的方法。18.一种使用自动染色装备在载玻片上对细菌进行革兰氏染色的方法，其中所述自动染色装备包含：用于放置多个载玻片的转盘式传送工具，每个上面都有待染色的样品用于以预定速度旋转所述转盘式传送工具的工具；和在所述转盘式工具旋转期间指引和控制各个试剂加载到所述载玻片和样品上的工具，且其中所述方法包括：将结晶紫试剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以使所述载玻片上的细菌与所述结晶紫试剂接触；将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去结晶紫试剂；将碘试剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以使所述载玻片上的细菌与所述碘试剂接触；将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去碘试剂；同时或分开地将慢作用脱色制剂和复染剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上；并将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去混合试剂。19.一种组合物，包含至少80％的一种或多种慢作用脱色剂和不超过20％的一种或多种快作用脱色剂。20.技术方案19的组合物，其中所述一种或多种慢作用脱色剂包含1,2-丙二醇、乙二醇或其混合物。21.一种用于自动化革兰氏染色的试剂盒，包含：在第一容器中的慢作用脱色制剂。22.技术方案21的试剂盒，进一步包含：在第二容器中的初级染色制剂；在第三容器中的捕获剂；和在第四容器中的复染色制剂。23.技术方案21或22的试剂盒，其中所述容器配置为加载到自动化染色装置中。24.技术方案23的试剂盒，其中所述自动化染色装置是VentanaNexESSpecialStainer或VentanaBenchMarkSpecialStainer。25.技术方案21-24中任一项的试剂盒，还包含一个或多个显微镜载玻片。26.技术方案21-25中任一项的试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对样品进行革兰氏染色的非诊断方法，包括：将所述样品加载到自动染色装置中；使所述样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁染色的条件下接触；使所述样品与捕获剂在足以形成初级染剂‑捕获剂复合物的条件下接触；使所述样品与慢作用脱色制剂在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌除去初级染剂‑捕获剂复合物的条件下接触，其中所述慢作用脱色制剂包含乙二醇；使所述样品与复染剂在足以将脱过色的革兰氏阴性细菌染色的条件下接触。

【技术特征摘要】
2012.03.19 US 61/612,5201.一种对样品进行革兰氏染色的非诊断方法，包括：将所述样品加载到自动染色装置中；使所述样品与初级染剂在足以将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁染色的条件下接触；使所述样品与捕获剂在足以形成初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触；使所述样品与慢作用脱色制剂在足以从革兰氏阴性细菌而非革兰氏阳性细菌除去初级染剂-捕获剂复合物的条件下接触，其中所述慢作用脱色制剂包含乙二醇；使所述样品与复染剂在足以将脱过色的革兰氏阴性细菌染色的条件下接触。2.权利要求1的非诊断方法，其中使所述样品与复染剂接触在使所述样品与慢作用脱色制剂接触的至少30秒后进行。3.权利要求1的非诊断方法，其中使所述样品与慢作用脱色制剂接触达至少30秒。4.权利要求3的非诊断方法，其中使所述样品与慢作用脱色制剂接触达至少60秒。5.权利要求1-4中任一项的非诊断方法，其中使用压缩空气完成所述样品与慢作用脱色制剂的接触。6.权利要求1-5中任一项的非诊断方法，其中所述慢作用脱色制剂包含慢作用脱色剂和快作用脱色剂。7.权利要求6的非诊断方法，其中所述慢作用脱色制剂包含至少80％的所述慢作用脱色剂和不超过20％的所述快作用脱色剂。8.权利要求1-7中任一项的非诊断方法，其中所述方法进一步包括检测革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。9.权利要求1-8中任一项的非诊断方法，其中所述初级染剂是结晶紫试剂且所述捕获剂是碘试剂。10.权利要求9的非诊断方法，其中所述自动染色装置包含：用于放置多个载玻片的转盘式传送工具，每个上面都有待染色的样品；用于以预定速度旋转所述转盘式传送工具的工具；和在所述转盘式工具旋转期间指引和控制各个试剂加载到所述载玻片和样品上的工具，且其中所述方法包括：将结晶紫试剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以使所述载玻片上的细菌与所述结晶紫试剂接触；将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去结晶紫试剂；将碘试剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以使所述载玻片上的细菌与所述碘试剂接触；将水、水性缓冲液、或水性去污剂指引到转盘式传送工具中的载玻片上以从所述载玻片洗去碘试剂；同时或分开地将慢作用脱色制剂和复染剂指引到转盘式传送工具中的载...

【专利技术属性】
技术研发人员：C维德纳，C康诺利，
申请(专利权)人：文塔纳医疗系统公司，
类型：发明
国别省市：美国,US