一种适用于牛BVDV、IBRV、PIV3、BRSV灭活疫苗的灭活检验方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于牛BVDV、IBRV、PIV3、BRSV灭活疫苗的灭活检验方法。本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种针对牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞体病毒灭活疫苗的灭活检验方法，包括以下步骤：1）灭活后的病毒液在适宜细胞上吸附40‑60min，期间振摇2‑3次；2）吸附后，在细胞转瓶中加入一定体积的细胞维持液继续培养，观察细胞病变，对于无细胞病变的病毒液，收获细胞培养液，并冻融2‑3次；3）取冻融后的细胞培养液10‑15ml，接种于适宜细胞上吸附，继续培养。进行观察和荧光检测，如没有特异性荧光，则表明灭活完全。本发明专利技术中公开的技术方案保证了抗原浓度和病毒感染时间。经本发明专利技术灭活检验方法检验病毒的检出率高，可以有效确保灭活疫苗的生物安全。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于牛BVDV、IBRV、PIV3、BRSV灭活疫苗的灭活检验方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种适用于牛病毒性腹泻（BVDV）、牛传染性鼻气管炎（IBRV）、牛副流感（PIV3）、牛呼吸道合胞体病毒病（BRSV）灭活疫苗的灭活检验方法，属于兽用医药生物领域。
技术介绍
疫苗免疫是防控疫病的重要手段，按疫苗中病原微生物是否存活，将疫苗分为灭活疫苗和活疫苗。灭活疫苗是将病原微生物用化学方法或物理方法使制造疫苗所用的微生物的活性、繁殖力或致病力消失，但仍保存相应抗原的免疫原性。灭活检验是灭活苗制备过程中重要的工艺之一，是保证疫苗生物安全的重要措施，因此，有效的灭活检验方法对疫苗的安全应用具有重要的意义。当前，不同灭活疫苗根据病原的特性，具有不同的灭活检验方法，但其最根本的是要通过简便、快速确定是否灭活完全，以保证环境生物安全、疫苗不散毒。由于不同灭活疫苗中病原的特性不同，因而需要根据病原的生长特点和灭活剂的特征设计形成不同的灭活检验方法。对于不同的病毒来说，方法没有迁移性和适用性。譬如猪圆环病毒灭活疫苗的灭活检验方法并不适用于牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的灭活检验。
技术实现思路
本专利技术的目的是设计一种适用于牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、牛副流感、牛呼吸道合胞体病毒病灭活疫苗的灭活检验方法。为了实现这一目的，本专利技术公开了一种灭活检验方法，包括以下步骤：1）根据待检测的需要，选择适宜牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感或者牛呼吸道合胞体病毒适宜生长的细胞系进行复苏培养，其中可供选择的细胞系包括牛肾细胞系（MDBK细胞系）、牛睾丸细胞（BT细胞系）、牛鼻甲骨细胞系（BT细胞系）、Vero细胞系、BHK21细胞系、牛原代细胞、MDCK细胞系、牛子宫细胞系（NCL-1细胞系）、NCL-1细胞系、兔肾原代细胞（CRL-1414）、兔肾细胞（LLC-RK1）。2）选用2个已长成良好细胞单层，密度达80%-90%的适宜体积的转瓶，弃去细胞培养液，取灭活后的病毒液20-30ml接种于细胞转瓶中，置37℃、含5%CO2培养箱中，使灭活后的病毒液在前述适宜细胞上吸附40-60min，期间振摇2-3次；3）吸附后，在细胞转瓶中加入一定体积的细胞维持液，将细胞转瓶置于37℃的CO2培养箱中继续培养3-4日后，观察细胞病变，对于无细胞病变的病毒液，收获细胞培养液，并冻融2-3次；4）取冻融后的细胞培养液10-15ml，接种于175cm2方瓶已生长至密度为80%-90%的适宜细胞上吸附40-60min后，在细胞转瓶中加入营养维持液，将细胞瓶置于37℃的CO2培养箱中继续培养3天，对于可出现细胞病变的病毒液，观察细胞病变，如无细胞病变，则表明灭活完全；5）对于正常不出现细胞病变的病毒液，收获培养液，进一步进行荧光染色。其中荧光染色的方式为：取正常不出现细胞病变的病毒培养液接种于长满单层适宜细胞的96孔细胞培养板内，每孔0.1mL，设阳性病毒对照孔和正常细胞对照孔各4孔，置于37℃的CO2培养箱中继续培养24小时，弃去培养液，用PBS清洗3次后，用80%丙酮和20%甲醇混合液0.1mL于-20℃固定30min，用PBS清洗3次后，分别加入工作浓度荧光标记的针对特异病毒的单克隆抗体0.1mL，37℃湿盒中作用40min后，用PBS清洗2次，置于荧光显微镜下观察结果。阳性病毒对照孔和正常细胞对照孔应无荧光。试验孔如没有特异性荧光，则表明灭活完全；如出现特异性荧光，则灭活不完全。进一步地，所述的细胞培养液、细胞维持液在细胞瓶中加入量为细胞瓶容量的1/8-1/15。更进一步地，所述细胞培养液为添加有新生牛血清、胎牛血清或者马血清的DMEM或MEM营养液；所述细胞维持液为添加有新生牛血清或胎牛血清的DMEM或MEM营养液。更进一步地，在细胞培养液中，新生牛血清、胎牛血清或者马血清的添加量为5%-10%；在细胞维持液中，新生牛血清或者胎牛血清的添加量为1%-3.5%。值得特别注意的是在本专利技术所公开的细胞培养液和细胞维持液中不含有抗生素。相较于现有技术，本专利技术在技术上具有两点重要革新：1）本专利技术所公开的灭活检验方法无需稀释灭活病毒液；2）应用荧光标记的单克隆抗体进行灭活检验能特异性的、直观的辨别某种不发生细胞CPE的病毒灭活情况。因此，本专利技术中公开的技术方案不仅保证了抗原浓度和病毒感染时间，而且经本专利技术灭活检验方法检验病毒的检出率高。本专利技术实现了病毒灭活检验的高准确性，可以有效提高灭活疫苗的安全性。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。如果没有特殊声明，本专利技术中所采用的试剂等均为市售产品。实施例1牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗的灭活检验方法细胞及细胞培养液：MDBK细胞，细胞培养液为含6%新生牛血清的DMEM营养液；细胞维持液为含3%马血清的DMEM营养液。1）将消化的MDBK细胞接种3000ml转瓶，培养48小时，至长成80%-90%良好细胞单层，弃去细胞培养液，取灭活后的MDBK细胞培养的牛病毒性腹泻病毒液25ml接种于细胞转瓶中，置37℃、含5%CO2培养箱中，使灭活后的病毒液在适宜细胞上吸附40min，期间振摇2次；2）吸附后，在细胞瓶中再加入175ml含3%马血清的DMEM细胞维持液，将细胞瓶置于37℃的CO2培养箱中继续培养3日后，观察细胞病变，如有细胞病变则表明灭活不合格，对于无细胞病变的病毒液，则收获细胞培养液，并冻融2次；3）取上述冻融后的细胞培养液15ml，接种于175cm2方瓶已生长至密度为80%-90%的MDBK细胞，细胞上吸附40min后，在细胞瓶中加入含3%马血清的细胞维持液，将细胞瓶置于37℃的CO2培养箱中继续培养3天。观察细胞病变，如无细胞病变，则表明灭活完全。对于正常不出现细胞病变的病毒液，收获培养液，进一步进行荧光染色。4）取正常不出现细胞病变的病毒培养液接种于长满单层MDBK细胞的96孔细胞培养板内，每孔0.1mL，设阳性病毒对照孔和正常细胞对照孔各4孔，置于37℃的CO2培养箱中继续培养24小时，弃去培养液，用PBS清洗后，用80%丙酮和20%甲醇混合液0.1mL-20℃固定30min，用PBS清洗后，分别加入2.5μg/ml的BVDV1型单克隆荧光抗体0.1mL，37℃湿盒中作用40min后，用PBS清洗2次，置于荧光显微镜下观察结果。阳性病毒对照孔和正常细胞对照孔应无荧光。试验孔如没有特异性荧光，则表明灭活完全；如出现特异性荧光，则灭活不完全。实施例2牛传染性鼻气管炎细胞毒灭活疫苗的灭活检验方法细胞及细胞培养液：MDBK细胞或BT细胞，细胞培养液为含6%新生牛血清的MEM营养液；细胞维持液为含3%新生牛血清的MEM营养液。1）将消化的MDBK细胞接种3000ml转瓶，培养48小时，至长成80%-90%良好细胞单层，弃去细胞培养液，取灭活后的MDBK细胞培养的牛传染性鼻气管炎病毒液25ml接种于细胞转瓶中，置37℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于牛BVDV、IBRV、PI3、BRSV灭活疫苗的灭活检验方法，其特征是，包括以下步骤：1）选择适宜牛病毒性腹泻病毒及牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感3型病毒或牛呼吸道合胞体病毒在适宜生长的细胞系进行复苏培养；2）选用2个已长成良好细胞单层，密度达80%‑90% 的适宜体积的转瓶，弃去细胞培养液，取灭活后的病毒液20‑30ml接种于细胞转瓶中，置37℃、含5%CO2培养箱中，使灭活后的病毒液在前述适宜细胞上吸附40‑60min，期间振摇2‑3次；3）吸附后，在细胞转瓶中加入一定体积的细胞维持液，将细胞转瓶置于37℃的CO2培养箱中继续培养3‑4日后，观察细胞病变，对于无细胞病变的病毒液，收获细胞培养液，并冻融2‑3次；4）取冻融后的细胞培养液10‑15ml，接种于175cm

【技术特征摘要】
1.一种适用于牛BVDV、IBRV、PI3、BRSV灭活疫苗的灭活检验方法，其特征是，包括以下步骤：1）选择适宜牛病毒性腹泻病毒及牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感3型病毒或牛呼吸道合胞体病毒在适宜生长的细胞系进行复苏培养；2）选用2个已长成良好细胞单层，密度达80%-90%的适宜体积的转瓶，弃去细胞培养液，取灭活后的病毒液20-30ml接种于细胞转瓶中，置37℃、含5%CO2培养箱中，使灭活后的病毒液在前述适宜细胞上吸附40-60min，期间振摇2-3次；3）吸附后，在细胞转瓶中加入一定体积的细胞维持液，将细胞转瓶置于37℃的CO2培养箱中继续培养3-4日后，观察细胞病变，对于无细胞病变的病毒液，收获细胞培养液，并冻融2-3次；4）取冻融后的细胞培养液10-15ml，接种于175cm2方瓶已生长至密度为80%-90%的适宜细胞上吸附40-60min后，在细胞转瓶中加入营养维持液，将细胞瓶置于37℃的CO2培养箱中继续培养3天，对于可出现细胞病变...

【专利技术属性】
技术研发人员：王炜，师新川，李真光，孟庆森，黄慧文，刘芳芳，季烨，武华，
申请(专利权)人：华威特江苏生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32