纯化血小板的制造方法技术

本发明专利技术提供一种方法，其是从巨核细胞的培养物制造纯化血小板的方法，包括利用150×g～550×g的离心力将上述培养物离心分离的第一离心分离工序以及利用600×g～4000×g的离心力将在第一离心分离工序中回收得到的液体成分离心分离的第二离心分离工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纯化血小板的制造方法
本专利技术涉及从巨核细胞的培养物制造纯化血小板的方法等。
技术介绍
对于随着手术时、受伤时的大量出血、或者表现出抗癌剂治疗后的血小板减少而出血趋势的患者而言，出于治疗和预防其症状的目的，向患者给予血小板制剂。目前，血小板制剂的制造依赖于通过健康志愿者进行的献血。但是，在日本，因人口结构而引起献血者数量减少，推测在2027年，存在大约100万人份的献血缺口。因此，血小板的稳定供给是本
的重要课题。另外，由于现有的血小板制剂因细菌污染导致的风险高，所以可能在血小板制剂的注入后引起严重感染。因此，在临床实践中，始终寻求更安全的血小板制剂。为了满足这种需求，如今开发了从在体外(invitro)培养出的巨核细胞中产生血小板的方法。在输入血小板制剂时，极少数情况下会发生输血副作用(荨麻疹、过敏反应等)。认为其原因之一在于血小板制剂中含有的血浆。因此，为了预防输血副作用，开发了用人工制备出的溶液(洗涤保存液)置换血小板制剂中的血浆的方法。例如，为了洗涤浓缩血小板制剂中的血小板，有使用具备分离转鼓的离心分离装置来洗涤血小板的方法。这里所说的浓缩血小板制剂是通过血液成分采集，除去白细胞的大部分，并将采集到的血小板悬浮在血浆中而得到的。另一方面，在体外培养巨核细胞而产生血小板的情况下，需要将血小板从巨核细胞分离并浓缩。由于两者的表面标记物相同，所以无法用细胞分选仪分离，为了分离血小板与巨核细胞，使用了利用大小差异而用过滤器和/或中空纤维膜分离的方法、使用离心管进行离心分离的方法。但是，在使用过滤器和/或中空纤维膜的方法中，因为表面蛋白质的损伤等而导致血小板的生理活性丧失，并且回收率低至10％左右。另外，在使用离心分离的方法中，由于采用低的离心速度以使得功能不降低，所以巨核细胞的去除率低，血小板回收率也仅为10％左右，另外，存在一次性能够纯化的量受到离心管的容积限制的问题。
技术实现思路
技术问题本专利技术的课题在于提供以高的回收率且一次性大量地从巨核细胞的培养物中分离纯化血小板来制造高品质的纯化血小板的方法。技术方案本专利技术人等为了解决上述课题反复进行了研究，结果发现，在利用预定的离心力将巨核细胞的培养物离心处理之后，通过利用更高的离心力对在该离心处理中得到的液体成分再一次进行离心处理，从而能够以高回收率从巨核细胞的培养物中纯化出高品质的血小板。即本专利技术提供：〔1〕一种方法，是从巨核细胞的培养物制造纯化血小板的方法，包括：第一离心分离工序，利用150×g～550×g的离心力将上述培养物离心分离；以及第二离心分离工序，利用600×g～4000×g的离心力将在第一离心分离工序中回收得到的液体成分离心分离；〔2〕根据〔1〕中记载的方法，上述离心分离工序通过离心分离来实施，上述离心分离装置具备：能够旋转的分离转鼓，其具备根据离心力使比重大的物质附着的内壁和使分离后的液体成分流出的流出口；以及回收单元，其对从上述流出口流出的液体成分进行回收。〔3〕根据〔2〕中记载的方法，上述方法还包括：洗涤工序，在上述第二离心分离工序之后，向上述分离转鼓加入洗涤液并使其旋转；以及血小板回收工序，在上述洗涤工序之后，加入回收液并使上述分离转鼓旋转；〔4〕根据〔2〕或〔3〕中记载的方法，第一离心分离工序通过使上述培养物自然下落而注入到分离转鼓；〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项记载的方法，上述巨核细胞的培养物是通过如下工序而得到的培养物，上述工序为：在与巨核细胞相比分化程度低的细胞中，使癌基因和多梳基因强制表达的工序；在上述细胞中使Bcl-xL基因强制表达的工序；以及将上述强制表达全部解除的工序；〔6〕一种血液制剂的制造方法，包括将利用〔1〕～〔3〕中任一项记载的方法纯化而成的血小板与其他成分混合的工序。专利技术效果根据本专利技术的方法，由于能够以高的回收率且一次性大量地从巨核细胞的培养物纯化出高品质的血小板，所以能够大量地生产、供给细菌污染风险低的安全的血小板制剂。附图说明图1表示对通过本专利技术的纯化方法纯化前后的血小板数进行测定而得到的结果。图2表示对通过本专利技术的纯化方法纯化后的血小板的生理活性进行测定而得到的结果。图3表示对通过本专利技术的纯化方法纯化后的异常血小板的比例进行测定而得到的结果。图4表示在利用本专利技术的纯化方法纯化之后6天后，对血小板的生理活性进行测定而得到的结果。图5表示在利用本专利技术的纯化方法纯化之后6天后，对异常血小板的比例进行测定而得到的结果。具体实施方式本专利技术的血小板的制造方法包括用不同的离心力对含有巨核细胞的试样进行2次以上的离心分离的工序。例如，第一离心分离工序可以以约150×g～约550×g的离心力实施，第二离心分离工序可以以约600×g～约4000×g的离心力实施。离心分离工序可以通过离心分离来实施，上述离心分离具备：能够旋转的分离转鼓，其具备与离心力对应地使比重大的物质附着的内壁和使分离后的液体成分流出的流出口；以及回收单元，其对从流出口流出的液体成分进行回收。在该离心分离装置中，使分离转鼓以穿过其底面的中心且与底面垂直的轴为中心旋转，并且如果注入液体混合物，则根据离心力，比重大的成分附着/堆积于分离转鼓的内壁，比重小的成分残留在液体中。含有比重小的成分的液体通过回收单元回收。回收单元例如由与分离转鼓的流出口连接的导管以及能够更换地与导管连接的回收袋构成。回收袋只要对血小板的品质不造成影响就没有特别限定，可以使用市售的血液、血液成分的保存用袋。对于该离心分离装置而言，边以预定的速度向分离转鼓注入液体混合物，边进行离心分离，同时能够用回收单元回收所分离出的液体，因此无论分离转鼓的容量如何，均能够连续地分离大量的液体混合物。作为本专利技术的纯化血小板制造方法中使用的离心分离装置，例如可以使用日本特开2005-296675号公报中公开的装置、日本特开平7-284529号公报中公开的装置等。另外，还可以使用血液成分的分离中使用的市售的离心分离装置、以往在浓缩血小板制剂的血小板的洗涤中使用的市售的装置。例如，还可以使用HAEMONETICS公司的ACP215、泰尔茂公司的COBE2991。在特定的方式中，第一离心分离工序可以以约150×g～约550×g的离心力使分离转鼓旋转来进行。离心力优选约160×g～约500×g，更优选约170×g～约400×g，进一步优选约180×g～约300×g。通过将离心力设为该范围来进行离心分离，从而使培养物中的巨核细胞附着/堆积于分离转鼓的内侧。如果使离心力为该范围以上，则由于对血小板施加剪应力，血小板的生理活性展现而导致聚集。应予说明，由于在离心力(g)、转速(rpm)与旋转半径(cm)之间成立以下的关系，所以所使用的旋转转鼓可以根据大小来决定转速。离心力(g)＝1119×旋转半径(cm)×(转速(rpm))2×10-8在该工序中，可以向巨核细胞的培养物中加入血小板保存液。例如可举出生物学的制剂基准血液保存液A液(Acid-Citrate-Dextrose；ACD-A；枸橼酸-葡萄糖)。ACD-A具有血液/血小板抗凝血作用，还发挥作为血小板的能量源的葡萄糖供给源的功能。在第一离心分离工序时，将巨核细胞的培养物注入到分离转鼓的方法没有特别限定，可以使用装置所具备的泵，也可以用导管将加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种方法，其特征在于，是从巨核细胞的培养物制造纯化血小板的方法，包括：第一离心分离工序，利用150×g～550×g的离心力将所述培养物离心分离；以及第二离心分离工序，利用600×g～4000×g的离心力将在第一离心分离工序中回收得到的液体成分离心分离。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.14 JP 2015-2032751.一种方法，其特征在于，是从巨核细胞的培养物制造纯化血小板的方法，包括：第一离心分离工序，利用150×g～550×g的离心力将所述培养物离心分离；以及第二离心分离工序，利用600×g～4000×g的离心力将在第一离心分离工序中回收得到的液体成分离心分离。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心分离工序通过离心分离装置来实施，所述离心分离装置具备：能够旋转的分离转鼓，其具备根据离心力使比重大的物质附着的内壁和使分离后的液体成分流出的流出口；以及回收单元，其对从所述流出口流出的液体成分进行回收。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包...

【专利技术属性】
技术研发人员：広瀬秀德，上田路子，
申请(专利权)人：株式会社美加细胞，
类型：发明
国别省市：日本,JP