一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包括以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物、nfo探针，其中所述RPA引物包括FMDV‑nfo‑F和FMDV‑nfo‑R，所述nfo探针为FMDV‑nfo‑P；所述检测方法以口蹄疫病毒3D基因为靶基因，以O型口蹄疫病毒RNA为模板进行RT‑RPA扩增，在反应体系中加入M‑MLV反转录酶和RNA酶抑制剂，用侧流层析试纸条进行检测。本发明专利技术建立的RT‑RPA法可以在较大的温度范围内操作，扩增时间短，显色反应肉眼可见，能脱离对大型仪器、专业操作人员及正规实验室的依赖。

【技术实现步骤摘要】
一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法
本专利技术关于生物检测
，尤其涉及一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)属于小RNA病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，存在O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT37个血清型，血清型间无交叉免疫现象。我国主要流行O型和A型，Asia1型自2009年后未见临床病例报道。对口蹄疫的早期预防和控制口蹄疫疫情传播所必须的重要手段。目前对口蹄疫病毒的检测主要依赖于分子检测方法，如RT-PCR和实时荧光RT-PCR，主要应用于装备良好的实验室，并需要配备精准昂贵的PCR设备和经过严格培训的技术人员，因此不适用于经济欠发达地区装备较差的实验室，更不适用于野外和现场检测。等温扩增方法不需要昂贵的精准扩增设备、连续的电力供应和复杂的样品处理，已经用于多种传染病包括动物疫病的快速检测，尤其是现场检测。近年来，针对口蹄疫病毒的系列等温检测方法主要包括反转录绝缘等温PCR(RT-iiPCR)、环介导等温扩增(RT-LAMP)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)、解旋酶恒温扩增(RT-HDA)和重组酶聚合酶扩增(RPA)等。RT-iiPCR依赖于专门的检测设备(POCKITTMAnalyser)，反应时间为60min；RT-LAMP需要6条引物，设计复杂，反应时间一般需要60min；NASBA和RT-HAD反应时间更长，分别需要90min和120min。上述等温检测方法反应时间较长，对检测结果的判定依赖于检测设备或琼脂糖凝胶电泳，因此，在野外现场应用时存在一定的限制，难以有效展开。RPA是一种操作简便、反应快速、特异性强、灵敏性高，并且成本较低的等温扩增技术，但现有技术中针对口蹄疫病毒建立的实时RT-RPA方法多依赖于昂贵的特异性荧光检测设备，不适用于经济欠发达地区装备较差的实验室，也不适用于野外现场的应用。如果样品需要在一定的冷链条件下运输到实验室检测，则需要较长的时间，从而造成检测结果的推迟，进而影响对发生的FMD疫情采取进一步的有效措施。
技术实现思路
针对现有技术中检测口蹄疫病毒所需反应时间长、需要使用昂贵设备进行检测、不适用于野外现场应用的技术问题，本专利技术提供了一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒及其检测方法。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒，包括以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物、nfo探针，扩增片段大小为258bp，其中所述RPA引物包括FMDV-nfo-F和FMDV-nfo-R，所述FMDV-nfo-F的序列为5′-3′TTGGTCACTCCATTACCGATGTCACTTTCCTC-3′，所述FMDV-nfo-R的序列为5′-Biotin-AACGCAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGGAAT-3′；所述nfo探针为FMDV-nfo-P，所述FMDV-nfo-P的序列为5′-FAM-GCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGAT(THF)TCCGTGGCAGGACTCG-C3-spacer-3′。该试剂盒中的引物和nfo探针对其他小RNA病毒扩增具有特异性，可以提高检测结果的准确性。以及，本专利技术还提供了一种口蹄疫病毒的可视化快速检测方法，以口蹄疫病毒3D基因为靶基因，以O型口蹄疫病毒RNA为模板进行RT-RPA扩增，在反应体系中加入M-MLV反转录酶和RNA酶抑制剂，用侧流层析试纸条进行检测。相对于现有技术而言，本专利技术由于以FMDVRNA作为模板直接进行扩增的RT-RPA，不需要进行将RNA反转录为cDNA的步骤，从而极大地节省了反应时间，简化了操作步骤。附图说明图1为本专利技术所建立的LFSRT-RPA方法反应时间的优化；图2为本专利技术所建立的LFSRT-RPA方法的特异性结果；图3为本专利技术所建立的LFSRT-RPA方法的灵敏性结果；图4为本专利技术所建立的LFSRT-RPA方法对部分临床样品的检测结果；附图说明：11加热5分钟的显色反应12加热10分钟的显色反应13加热15分钟的显色反应14加热20分钟的显色反应21O型FMDV的检测结果22A型FMDV的检测结果23Asia1型FMDV的检测结果24水泡性口炎病毒的检测结果25猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测结果26猪瘟病毒的检测结果27猪脑心肌炎病毒的检测结果28伪狂犬病毒的检测结果29猪圆环病毒2型的检测结果31RNA浓度为1.0×107copes/μL的检测结果32RNA浓度为1.0×106copes/μL的检测结果33RNA浓度为1.0×105copes/μL的检测结果34RNA浓度为1.0×104copes/μL的检测结果35RNA浓度为1.0×103copes/μL的检测结果36RNA浓度为1.0×102copes/μL的检测结果37RNA浓度为1.0×101copes/μL的检测结果38RNA浓度为1.0×100copes/μL的检测结果41对O型FMDV无细胞病毒液的检测结果42对A型FMDV无细胞病毒液的检测结果43对Asial型FMDV无细胞病毒液的检测结果44随机抽取的对O型FMDV模拟血清样品的检测结果45随机抽取的对O型FMDV模拟血清样品的检测结果46随机抽取的对O型FMDV模拟血清样品的检测结果47健康血清样品与FMDV按200：1混合所得血清样品的检测结果48健康血清样品与FMDV按400：1混合所得血清样品的检测结果49随机抽取的健康血清样品的检测结果具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒，包括以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物、nfo探针，扩增片段大小为258bp，其中所述RPA引物包括FMDV-nfo-F和FMDV-nfo-R，所述FMDV-nfo-F的序列为5′-3′TTGGTCACTCCATTACCGATGTCACTTTCCTC-3′，所述FMDV-nfo-R的序列为5′-Biotin-AACGCAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGGAAT-3′；所述nfo探针为FMDV-nfo-P，所述FMDV-nfo-P的序列为5′-FAM-GCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGAT(THF)TCCGTGGCAGGACTCG-C3-spacer-3′。该试剂盒中的引物和nfo探针对其他小RNA病毒扩增具有特异性，可以提高检测结果的准确性。进一步优选地，所述FMDV-nfo-F、FMDV-nfo-R和FMDV-nfo-P的浓度均为10μmol/L，所述FMDV-nfo-F、FMDV-nfo-R的用量均为2.1μL，所述FMDV-nfo-P的用量为0.6μL。进一步优选地，所述的用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒还包括Trizol试剂、M-MLF反转录酶、RNA酶抑制剂、O型口本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒，其特征在于，包括以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物、nfo探针，扩增片段大小为258bp，其中所述RPA引物包括FMDV‑nfo‑F和FMDV‑nfo‑R，所述FMDV‑nfo‑F的序列为5′‑3′TTGGTCACTCCATTACCGATGTCACTTTCCTC‑3′，所述FMDV‑nfo‑R的序列为5′‑Biotin‑AACGCAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGGAAT‑3′；所述nfo探针为FMDV‑nfo‑P，所述FMDV‑nfo‑P的序列为5′‑FAM‑GCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGAT(THF)TCCGTGGCAGGACTCG‑C3‑spacer‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒，其特征在于，包括以口蹄疫病毒3D基因为模板设计RPA引物、nfo探针，扩增片段大小为258bp，其中所述RPA引物包括FMDV-nfo-F和FMDV-nfo-R，所述FMDV-nfo-F的序列为5′-3′TTGGTCACTCCATTACCGATGTCACTTTCCTC-3′，所述FMDV-nfo-R的序列为5′-Biotin-AACGCAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGGAAT-3′；所述nfo探针为FMDV-nfo-P，所述FMDV-nfo-P的序列为5′-FAM-GCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGAT(THF)TCCGTGGCAGGACTCG-C3-spacer-3′。2.根据权利要求1所述的用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒，其特征在于，所述FMDV-nfo-F、FMDV-nfo-R和FMDV-nfo-P的浓度均为10μmol/L，所述FMDV-nfo-F、FMDV-nfo-R的用量均为2.1μL，所述FMDV-nfo-P的用量为0.6μL。3.根据权利要求1或2所述的用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒，其特征在于，还包括Trizol试剂、M-MLF反转录酶、RNA酶抑制剂、O型口蹄疫病毒RNA、nfo-RPA反应重悬缓冲液、冻干酶制剂、醋酸镁、双蒸水、侧流层析试纸条反应缓冲液。4.根据权利要求3所述的用于口蹄疫病毒的可视化快速检测的检测试剂盒，其特征在于：所述M-MLV反转录酶的浓度为200U/μL，用量为1μL；所述RNA酶抑制剂的浓度为40U/μL，用量为1μL；所述O型口蹄疫病毒RNA用量为1μL；所述nfo-RPA反应重悬缓冲液为20％聚乙二醇，用量为29.5μL；所述双蒸水的用量为10.2μL；所述醋酸镁浓度为280mmol/L，用量为2.5μL；所述冻干酶制剂中包括dNTP、单链结合蛋白、recA重组酶、BsuDNA聚合酶、内切核酸酶IV，三(羟甲基)甲基甘氨酸、聚乙二醇、二硫苏糖醇和肌酸激酶。5.一种口蹄疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建昌，刘立兵，王金凤，石蕊寒，
申请(专利权)人：河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：河北,13