一种威灵仙种子超低温保存方法技术

本发明专利技术提供一种威灵仙种子超低温保存方法，步骤包括以下：威灵仙种子用A试剂处理，处理20～60min后，取出处理过的威灵仙种子；再放入装有B试剂的冻存管中，室温温育10～30min，再将其放入梯度降温盒中；将带有威灵仙种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐55℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用。

【技术实现步骤摘要】
一种威灵仙种子超低温保存方法
本专利技术涉及一种威灵仙种子超低温保存方法，属于现代中草药种质保护

技术介绍
威灵仙别名铁脚威灵仙、铁角威灵仙、铁脚灵仙、铁脚铁线莲，为毛茛科植物，藤本。新鲜茎光滑无毛，有明显的纵行纤维条纹。茎叶干后变黑色。羽状复叶对生，粉绿色，光滑；小叶3～5，狭卵形至三角状卵形，长3～7cm，宽1.5～3.6cm，先端钝或渐尖，基部楔形或圆形，全缘，上面沿脉有毛；叶柄长4.5～6.5cm。圆锥花序腋生或顶生；花被片一，白色，外面边缘密生白色短柔毛。瘦果狭卵形而扁，疏生柔毛。花期6～8月，果期9～10月。生于山坡、山谷或灌丛中。根茎呈不规则块状，黄褐色，上端残留木质茎基，下侧丛生多数细根。根细长圆柱形，长约8～16厘米，直径约1～4毫米，略弯曲，表面棕褐色或棕黑色，有细纵纹。质坚脆易折断，皮部与木部易脱离，断面平坦，类圆形，皮部灰黄色，木部黄白色。根茎质较坚韧，断面不平坦，纤维性。气微弱。味微苦。以条匀，皮黑、肉白、坚实者为佳。主产江苏、安徽、浙江等地，山东、四川、广东、福建等地亦产。为了满足用药的需要，对威灵仙进行大量人工栽培，目前对威灵仙种子需求量增加，但野生采挖严重，对种质资源影响很大。目前种质资源保存方式为常温、低温保存威灵仙种子两种方式。常温保存中草药种子，每年就需要重新繁种更新，因为中草药种子经过一年的保存，活力降低很快，只有25％左右；低温保存中草药种子，在中国，建立了国家中期库和国家种质库，国家中期库保存的温度为4℃左右，相对湿度小于65％，一般设计贮藏种子的寿命为5～10年，国家种质库为种质长期保存库，库中的温度为-18℃左右，相对湿度小于50％，设计贮藏寿命达20年以上，也就是说种质在长期库中保存，活力同样随着时间的推移降低，种质20年后一般需要更新繁种，不是永久的保存。因此，为了安全保存威灵仙种质资源，研究探索一种安全而长久保存威灵仙种质资源的方法很有意义，它能够减少或者避免种子更新繁种，省时省力，阻断繁种更新的过程中种质间基因漂移等产生种质变异，保证种质的遗传稳定性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适合于威灵仙种子的超低温保存法，该方法能够补充现在威灵仙种质资源保存技术的不足，可以长期安全的保存威灵仙种质资源，为威灵仙种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。本专利技术的目的是提供一种威灵仙种子超低温保存方法，包括步骤以下：(1)室温下将威灵仙种子用A试剂处理，处理20～60min后，取出处理过的威灵仙种子；(2)处理过的威灵仙种子放入装有B试剂的冻存管中，室温温育10～30min，再将其放入梯度降温盒中；(3)将带有威灵仙种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在-35℃～-55℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用。在一个具体方案中，步骤(1)中所述A试剂是指B5液体培养液，还包含有1～1.5mol/L甘油和1.1～1.7mol/L二甲基亚砜。在一个具体方案中，步骤(2)中所述梯度降温盒中含有100％异丙醇或甘油，可以重复使用。在一个具体方案中，步骤(2)中所述B试剂是指B5液体培养液，还包含有1.5～2.4mol/L甘油、1.4～2.2mol/L二甲基亚砜和0.6～0.9mol/L蔗糖。在一个具体方案中，步骤(3)中所述低温冰箱的温度要求一般在-70℃以下。上述所保存的威灵仙种子进行解冻时，若室温超过20℃，将冻存管从液氮中取出，直接利用室温自然解冻；若室温低于20℃，将冻存管从液氮中取出，并置于20～24℃水浴箱中解冻。解冻完后，取出冻存管中威灵仙种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤3～5次，清洗后威灵仙种子直接用于培养。技术效果1、本专利技术进行威灵仙超低温保存，工艺简单，稳定性可靠，保存后的威灵仙种子的发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，发芽试验结果表明超低温保存后威灵仙种子发芽率高达90％以上。2、本专利技术具有长期、有效、安全保存威灵仙种子，是威灵仙种质资源长期保存的最有效方法。具体实施方式下面，本专利技术将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任何一个或类似实例。实施例1取湖南某地当年收获的威灵仙，自然晒干，将含水量10％左右的威灵仙种子用含有1.2mol/L甘油和1.65mol/L二甲基亚砜的B5液体培养液处理，处理25min后，取出处理过的威灵仙种子，再放入含有2mol/L甘油、1.8mol/L二甲基亚砜和0.8mol/L蔗糖的B5液体培养液的冻存管中，室温温育30min，再将其放入梯度降温盒中；威灵仙将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-45℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存10年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中威灵仙种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后威灵仙种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到94.27％。对照实施例1取湖南某地当年收获的威灵仙，自然晒干，将含水量10％左右的威灵仙种子用含有1.2mol/L甘油的B5液体培养液处理，处理25min后，取出处理过的威灵仙种子，再放入含有2mol/L甘油、1.8mol/L二甲基亚砜和0.8mol/L蔗糖的B5液体培养液的冻存管中，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-45℃，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存10年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中威灵仙种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后威灵仙种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到78.49％。对照实施例2取湖南某地当年收获的威灵仙，自然晒干，将含水量10％左右的威灵仙种子用含有1.2mol/L甘油和1.65mol/L二甲基亚砜的B5液体培养液处理，处理25min后，取出处理过的威灵仙种子，再放入含有2mol/L甘油、1.8mol/L二甲基亚砜和0.8mol/L蔗糖的B5液体培养液的冻存管中，室温温育30min，再将其放入在-5℃左右低温冰箱保存10年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中威灵仙种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后威灵仙种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到28.61％。而取新鲜威灵仙1～5℃下低温保存10年后，用于发芽实验，经测试威灵仙未能发芽。实施例2取湖南某地当年收获的威灵仙，自然晒干，将含水量7.5％左右的威灵仙种子用含有1.4mol/L甘油和1.45mol/L二甲基亚砜的B5液体培养液处理，处理30min后，取出处理过的威灵仙种子，再放入含有2.15mol/L甘油、1.7mol/L二甲基亚砜和0.75mol/L蔗糖的B5液体培养液的冻存管中，室温温育20min，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进-80℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在-55℃左右，降温速度为-1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存10年后，将冻存管从液氮中取出，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种威灵仙种子超低温保存方法，包括步骤以下：(1)室温下将威灵仙种子用A试剂处理，处理20～60min后，取出处理过的威灵仙种子；(2)处理过的威灵仙种子放入装有B试剂的冻存管中，室温温育10～30min，再将其放入梯度降温盒中；(3)将带有威灵仙种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐55℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用。

【技术特征摘要】
1.一种威灵仙种子超低温保存方法，包括步骤以下：(1)室温下将威灵仙种子用A试剂处理，处理20～60min后，取出处理过的威灵仙种子；(2)处理过的威灵仙种子放入装有B试剂的冻存管中，室温温育10～30min，再将其放入梯度降温盒中；(3)将带有威灵仙种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐55℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用。2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)所述A试剂是指B5液体培养液，还包含有1～1.5mol/L甘油和1.1～1.7mol/L二甲基亚砜。3.根据权利要求1的方法，其中所述A试剂优选110～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。4.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗婵，
申请(专利权)人：长沙爱扬医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43