通用供体干细胞和相关方法技术

本文公开了通用供体干细胞以及其使用和产生的相关方法。本文公开的通用供体干细胞可用于克服基于细胞的移植疗法中的免疫排斥。在某些实施方式中，本文公开的通用供体干细胞不表达一种或多种MHC‑I和MHC‑II人类白细胞抗原。类似地，在某些实施方式中，本文公开的通用供体干细胞不表达一种或多种对应于MHC‑I和MHC‑II人类白细胞抗原的人类白细胞抗原(例如HLA‑A、HLA‑B和/或HLA‑C)，从而使这些细胞具有低免疫原性。

General donor stem cells and related methods

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通用供体干细胞和相关方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年5月8日提交的美国临时申请第62/158,999号的权益，其内容在此以全文引用的方式并入。政府支持本专利技术是在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的DK097768的政府支持下完成的。政府在本专利技术中有特定的权利。
技术介绍
退行性疾病对人类健康造成了不成比例的威胁。这些疾病通常与年龄有关，导致受影响的组织和器官逐渐恶化，最终导致受影响的对象残疾和死亡。再生医学的承诺是用新的健康细胞替代病变或丢失的细胞。在过去的五年中，再生医学的新范式已经出现——使用人类多能干细胞(hPSC)来产生任何成人细胞类型以移植到患者中。原则上，基于hPSC的细胞疗法有可能治疗大部分(如果不是全部)退行性疾病，但是这些疗法的成功可能受限于对象的免疫应答。已经被考虑来克服免疫排斥的策略包括HLA匹配(例如同卵双胞胎或脐带库)，向对象施用免疫抑制药物，阻断抗体，骨髓抑制/混合嵌合体，HLA匹配的干细胞储库和自体干细胞疗法。需要新的手段、组合物和方法来克服与细胞替代疗法相关的免疫排斥。
技术实现思路
本文公开了通过产生通用供体干细胞系来克服基于细胞的移植疗法中的免疫排斥的有效策略，所述通用供体干细胞系作为质量受控的基于细胞的产物将形成再生细胞疗法的基础。专利技术人已经成功地在人类多能干细胞中使用基因组编辑工具(诸如TALEN和/或CRISPR系统)来降低高度多态的经典MHC-I基因(HLA-A、HLA-B和HLA-C)和/或MHC-II基因的表达或敲除所述基因。在某些方面，通过直接和/或间接靶向NLRC5、B2M和CIITA基因以及MHC增强子体的其他组分(例如MHC-I或MHC-II的转录调节因子)来实现MHC-I和/或MHC-II基因的这种降低的表达或敲除。本文公开了制备低免疫原性干细胞的方法，所述方法包含调节干细胞的一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达，从而制备低免疫原性干细胞。还公开了调节干细胞的一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达的方法，其包含从细胞的至少一个等位基因中缺失编码MHC-I或MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，从而调节一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达。在某些方面，调节一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达包含降低、抑制和/或干扰一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达。在某些实施方式中，调节一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达包含从细胞的至少一个等位基因中缺失编码MHC-I或MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因。例如，在某些实施方式中，这些方法包含使编码MHC-I或MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因缺失，所述转录调节因子选自NLRC5、CIITA、B2M和其组合。在某些方面，本文公开的方法还包含调节干细胞的一种或多种致耐受性因子(tolerogenicfactor)的表达。调节致耐受性因子的表达可以包含增加致耐受性因子的表达。可以将这些致耐受性因子插入细胞的至少一个等位基因的安全港(safeharbor)基因座(例如，AAVS1基因座)中。在某些实施方式中，这些致耐受性因子抑制免疫排斥。在某些实施方式中，这些致耐受性因子选自：HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、C1-抑制因子和IL-35。本文还公开了制备低免疫原性干细胞的方法，所述方法包含调节干细胞的一种或多种致耐受性因子的表达，从而制备低免疫原性干细胞。在某些实施方式中，调节致耐受性因子的表达包含增加致耐受性因子的表达。可以将这些致耐受性因子插入细胞的至少一个等位基因的安全港基因座(例如，AAVS1基因座)中。在某些实施方式中，这些致耐受性因子选自：HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、C1-抑制因子和IL-35。在某些实施方式中，这些致耐受性因子抑制干细胞的免疫排斥或由所述干细胞制备的分化干细胞的免疫排斥。在某些方面，公开的方法还包含调节细胞的一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达，例如通过从细胞的至少一个等位基因中缺失编码MHC-I或MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因。在某些实施方式中，MHC-I或MHC-II的转录调节因子选自NLRC5、CIITA、B2M和其组合。本文还公开了不表达NLRC5的人类干细胞(例如，NLRC5-/-敲除突变干细胞)。类似地，还公开了不表达CIITA的人类干细胞(例如，CIITA-/-敲除突变干细胞)。还公开了不表达B2M的人类干细胞(例如，B2M-/-敲除突变干细胞)。在某些实施方式中，还提供了不表达NLRC5、CIITA和B2M中的一种或多种的人类干细胞。在其它实施方式中，还公开了不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种的人类干细胞。在某些实施方式中，本文公开的干细胞表达一种或多种致耐受性因子(例如一种或多种抑制免疫排斥的致耐受性因子)。在某些方面，将这些致耐受性因子插入细胞的至少一个等位基因的安全港基因座(例如，AAVS1基因座)中。在某些实施方式中，致耐受性因子选自：HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、C1-抑制因子和IL-35。在一些实施方式中，细胞是胚胎干细胞。在某些实施方式中，细胞是多能干细胞。在某些实施方式中，干细胞是低免疫原性的。在一些实施方式中，相对于原始基因型或相对于野生型人类干细胞，细胞具有降低的MHC-I表达。在某些实施方式中，相对于原始基因型或相对于野生型人类干细胞，细胞具有降低的MHC-II表达。例如，相对于原始基因型或相对于野生型人类干细胞，这些细胞的HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种的表达可能降低。本文还公开了如下人类干细胞，所述人类干细胞已经被改变以使得它们包含插入细胞的至少一个等位基因的安全港基因座(例如，AAVS1基因座)中的一种或多种致耐受性因子。在某些实施方式中，这些致耐受性因子抑制免疫排斥。在某些实施方式中，致耐受性因子选自：HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、C1-抑制因子和IL-35。在某些方面，这些细胞不表达NLRC5、CIITA和B2M中的一种或多种。在某些方面，这些细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种。在某些实施方式中，相对于野生型人类干细胞，这些细胞的HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种的表达降低。本文还公开了使用本文公开的低免疫原性细胞进行细胞替代疗法的方法。例如，本文公开的通用干细胞可以在适当条件下温育并分化成低免疫原性心肌细胞、内皮细胞、肝细胞或胰腺β细胞。本文还公开了用于产生低免疫原性干细胞的方法，所述方法包含使干细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自SEQIDNO:36353-81239的序列的第一核糖核酸对接触，从而编辑NLRC5基因以降低或消除细胞中的NLRC5表面表达和/或活性。还公开了用于产生低免疫原性干细胞的方法，所述方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干细胞，其相对于野生型干细胞，包含一种或多种MHC‑I和MHC‑II人类白细胞抗原的受调节的表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.08 US 62/158,9991.一种干细胞，其相对于野生型干细胞，包含一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的受调节的表达。2.一种干细胞，其相对于野生型干细胞，包含一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的受调节的表达，其中所述低免疫原性干细胞在所述细胞的至少一个等位基因中缺失编码MHC-I或MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因。3.根据权利要求1至2所述的干细胞，其中所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的受调节的表达包含所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达降低。4.根据权利要求1至2所述的干细胞，其中所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的受调节的表达包含所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达受抑制。5.根据权利要求1至2所述的干细胞，其中所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的受调节的表达包含所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达受干扰。6.根据权利要求1所述的干细胞，其中所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的受调节的表达包含从所述细胞的至少一个等位基因中缺失编码MHC-I或MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因。7.根据权利要求6所述的干细胞，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子选自NLRC5、CIITA和B2M。8.根据权利要求6所述的干细胞，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子包含NLRC5。9.根据权利要求6所述的干细胞，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子包含CIITA。10.根据权利要求6所述的干细胞，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子包含B2M。11.根据权利要求1所述的干细胞，其相对于野生型干细胞，还包含一种或多种致耐受性因子的受调节的表达。12.根据权利要求11所述的干细胞，其中所述致耐受性因子的受调节的表达包含所述致耐受性因子的表达增加。13.根据权利要求11所述的干细胞，其中所述致耐受性因子被插入所述细胞的至少一个等位基因的安全港基因座中。14.根据权利要求11所述的干细胞，其中所述安全港基因座包含AAVS1基因座。15.根据权利要求11所述的干细胞，其中所述致耐受性因子抑制免疫排斥。16.根据权利要求11所述的干细胞，其中所述致耐受性因子选自：HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、C1-抑制因子和IL-35。17.根据权利要求1至2所述的干细胞，其中所述干细胞是胚胎干细胞。18.根据权利要求1至2所述的干细胞，其中所述干细胞是多能干细胞。19.根据权利要求1至2所述的干细胞，其中所述干细胞是低免疫原性的。20.根据权利要求1至2所述的干细胞，其中所述干细胞是人类干细胞。21.根据权利要求1至2所述的干细胞，其中所述细胞不表达NLRC5、CIITA和B2M中的一种或多种。22.根据权利要求1至2所述的干细胞，其中所述细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种。23.根据权利要求1至2所述的干细胞，其中相对于野生型干细胞，所述细胞的HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种的表达降低。24.一种干细胞，其相对于野生型人类干细胞，包含一种或多种致耐受性因子的受调节的表达。25.根据权利要求24所述的干细胞，其中所述致耐受性因子的受调节的表达包含所述致耐受性因子的表达增加。26.根据权利要求24所述的干细胞，其中所述致耐受性因子被插入所述细胞的至少一个等位基因的安全港基因座中。27.根据权利要求26所述的干细胞，其中所述安全港基因座包含AAVS1基因座。28.根据权利要求24所述的干细胞，其中所述致耐受性因子抑制免疫排斥。29.根据权利要求24所述的干细胞，其中所述干细胞是胚胎干细胞。30.根据权利要求24所述的干细胞，其中所述干细胞是多能干细胞。31.根据权利要求24所述的干细胞，其中所述干细胞是低免疫原性的。32.根据权利要求24所述的干细胞，其中所述干细胞是人类干细胞。33.根据权利要求24所述的干细胞，其中所述致耐受性因子选自：HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、C1-抑制因子和IL-35。34.根据权利要求24所述的干细胞，其相对于野生型干细胞，还包含一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的受调节的表达。35.根据权利要求34所述的干细胞，其中所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的受调节的表达包含从所述细胞的至少一个等位基因中缺失编码MHC-I或MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因。36.根据权利要求24所述的干细胞，其还包含从所述细胞的至少一个等位基因中缺失编码MHC-I或MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因。37.根据权利要求35至36所述的干细胞，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子选自NLRC5、CIITA和B2M。38.根据权利要求35至36所述的干细胞，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子包含NLRC5。39.根据权利要求35至36所述的干细胞，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子包含CIITA。40.根据权利要求35至36所述的干细胞，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子包含B2M。41.一种人类干细胞，其不表达NLRC5。42.根据权利要求41所述的细胞，其中所述细胞是NLRC5-/-敲除干细胞。43.一种人类干细胞，其不表达CIITA。44.根据权利要求43所述的细胞，其中所述细胞是CIITA-/-敲除干细胞。45.一种人类干细胞，其不表达B2M。46.根据权利要求45所述的细胞，其中所述细胞是B2M-/-敲除干细胞。47.一种人类干细胞，其不表达NLRC5、CIITA和B2M中的一种或多种。48.一种人类干细胞，其不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种。49.根据权利要求41至48所述的细胞，其中所述细胞表达一种或多种致耐受性因子。50.根据权利要求49所述的细胞，其中所述致耐受性因子抑制免疫排斥。51.根据权利要求49所述的细胞，其中所述致耐受性因子被插入所述细胞的至少一个等位基因的安全港基因座中。52.根据权利要求51所述的细胞，其中所述安全港基因座包含AAVS1基因座。53.根据权利要求51所述的细胞，其中所述致耐受性因子选自：HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、C1-抑制因子和IL-35。54.根据权利要求41至48所述的细胞，其中所述细胞是胚胎干细胞。55.根据权利要求41至48所述的细胞，其中所述细胞是多能干细胞。56.根据权利要求41至48所述的细胞，其中所述干细胞是低免疫原性的。57.根据权利要求41至48所述的细胞，其中相对于野生型人类干细胞，所述细胞具有降低的MHC-I表达。58.根据权利要求41至48所述的细胞，其中相对于野生型人类干细胞，所述细胞具有降低的MHC-II表达。59.根据权利要求41至48所述的细胞，其中相对于野生型人类干细胞，所述细胞的HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种的表达降低。60.一种使用根据权利要求41至48所述的细胞进行细胞替代疗法的方法。61.一种人类干细胞，其包含一种或多种致耐受性因子，所述致耐受性因子被插入所述细胞的至少一个等位基因的安全港基因座中。62.根据权利要求61所述的细胞，其中所述致耐受性因子抑制免疫排斥。63.根据权利要求61所述的细胞，其中所述致耐受性因子选自：HLA-C、HLA-E、HLA-G、PD-L1、CTLA-4-Ig、CD47、C1-抑制因子和IL-35。64.根据权利要求61所述的细胞，其中所述安全港基因座包含AAVS1基因座。65.根据权利要求61所述的细胞，其中所述细胞不表达NLRC5、CIITA和B2M中的一种或多种。66.根据权利要求61所述的细胞，其中所述细胞不表达HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种。67.根据权利要求61所述的细胞，其中相对于野生型人类干细胞，所述细胞的HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一种或多种的表达降低。68.一种制备低免疫原性干细胞的方法，所述方法包含调节干细胞的一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达，从而制备所述低免疫原性干细胞。69.一种调节干细胞的一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达的方法，所述方法包含从所述细胞的至少一个等位基因中缺失编码MHC-I或MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因，从而调节所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达。70.根据权利要求68至69所述的方法，其中调节所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达包含降低所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达。71.根据权利要求68至69所述的方法，其中调节所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达包含抑制所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达。72.根据权利要求68至69所述的方法，其中调节所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达包含干扰所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达。73.根据权利要求68所述的方法，其中调节所述一种或多种MHC-I和MHC-II人类白细胞抗原的表达包含从所述细胞的至少一个等位基因中缺失编码MHC-I或MHC-II的一种或多种转录调节因子的一个或多个基因。74.根据权利要求73所述的方法，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子选自NLRC5、CIITA和B2M。75.根据权利要求73所述的方法，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子包含NLRC5。76.根据权利要求73所述的方法，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子包含CIITA。77.根据权利要求73所述的方法，其中MHC-I或MHC-II的所述转录调节因子包含B2M。78.根据权利要求68所述的方法，其还包含调节所...

【专利技术属性】
技术研发人员：托斯滕·B·迈斯纳，罗纳尔多·M·R·费雷拉，杰克·L·施特罗明格，沙达·A·考恩，
申请(专利权)人：哈佛学院校长同事会，
类型：发明
国别省市：美国,US