用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的复合物的制备及应用制造技术

用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的复合物的制备及应用。金属离子配体与磷酸酯基团之间具有强相互作用，这种作用不仅可以增强金属离子配体对核酸分子的结合能力，而且可以提高细胞内吞效率和内涵体逃逸性能。可用的配位单元包括含吡啶环类基团，咪唑环类基团或多氮环类基团。不同于以往复杂的化学共价修饰，将金属离子配体简单加入到其他载体材料中，即作为一种第三组分，也会大幅度提高原载体材料的转染效率。如此形成的复合物对核酸分子压缩更紧密，纳米粒子的细胞内吞效率和内涵体逃逸性能也大幅度提高，最终在肿瘤细胞系和干细胞中均展现出极高的转染效率。此方法操作简单，效率高，具有非常好的临床应用前景。

Preparation and application of a complex of metal ion ligands used for non viral gene carrier materials

【技术实现步骤摘要】
用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的复合物的制备及应用
本专利技术属于基因治疗及新材料领域，具体涉及一种用于非病毒基因载体材料的金属离子配体的制备及应用。
技术介绍
基因治疗是一种将特定核酸分子导入病变细胞或组织，用以治疗人类诸多疾病的手段。为实现这一目标，研究者需要高效安全的基因载体。目前的基因载体分为两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然效率很高，但是容易引起免疫原性，安全性因素限制了其临床应用。非病毒载体则具有安全性高，结构便于调控的优点，但其效率远远低于病毒载体。因此，提高非病毒载体的转染效率成为实现基因治疗的关键。基因转染过程主要包括:载体材料压缩核酸分子形成复合物；复合物被摄取进入细胞；复合物从内涵体中逃逸出来；复合物在细胞质中解离释放出核酸分子；核酸分子进一步表达。目前非病毒载体主要分为阳离子聚合物和脂质体两大类，单独一个材料同时实现上述功能非常具有挑战性。尤其复合物被细胞摄取和内涵体逃逸两个因素对非病毒载体材料的效率评估非常重要。目前研究者主要通过化学共价修饰的方式提高这些性能，但这又会一定程度上改变原来基因载体材料的性质。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述存在问题，提供一种金属离子配体充当第三组分，与核酸分子和聚合物或脂质体载体材料混合共同形成复合物的方法，得到极高的转染效率，有望应用于临床治疗；该方法中金属离子配体可提高与细胞膜的相互作用和内涵体逃逸的功能，制备简单。本专利技术的技术方案：用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的复合物，该复合物以金属离子配体作为第三组分，与聚合物或脂质体中的一种或多种一起作为非病毒载体材料，包裹核酸分子和/或拟递送入细胞的其它货物分子形成复合物，用以基因转染和药物递送。所述金属离子配体由配位金属和配位单元组成；其中，配位金属包括锌、镁、钙、铝、铁、铜、铕或钆；配位单元包括含吡啶环类基团，咪唑环类基团或多氮环类基团或者是上述几种的混合物。所述聚合物包括天然聚合物和化学合成聚合物。天然聚合物包括聚赖氨酸(PLL)，壳聚糖(CS)，环糊精(CD)，透明质酸(HA)及其各自衍生物，但不局限于上述天然聚合物。化学合成聚合物，包括聚乙烯亚胺(PEI)，聚丙烯亚胺(PPI)，聚酰胺-胺(PAMAM)，聚氨酯(PAE)，多肽，聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)，聚二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺(PDMAPMA)，聚丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEA)，聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(PDEAEMA)，聚N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(PAPMA)，聚N-(2-氨基乙基)丙烯酰胺(PAEAA)，聚N-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺(PAEMA)及其各自衍生物，但不局限于上述化学合成聚合物。所述脂质体，包括氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)，二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)，二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)，溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)，溴化二甲基-2-羟乙基-2,3-双十四烷氧基丙基铵(DMRIE)，N-(2-精胺甲酰基)-N,N’-双十八烷基甘氨酰胺(DOGS)，3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)，但不局限于上述脂质体。所述复合物制备过程包括如下三种方法：方法1、金属离子配体首先和聚合物或脂质体中的一种或多种混合，然后包裹核酸分子和/或拟递送入细胞的其它货物分子；方法2、或者金属离子配体首先和核酸分子和/或拟递送入细胞的其它货物分子混合，然后聚合物或脂质体中的一种或多种压缩混合后的核酸分子和/或拟递送入细胞的其它货物分子；方法3、或者聚合物或脂质体中的一种或多种首先加入到核酸分子和/或拟递送入细胞的其它货物分子中压缩核酸分子和/或拟递送入细胞的其它货物分子，然后金属离子配体加入其中形成最终复合物。所述金属离子配体与聚合物或脂质体总量的摩尔比为0.1-1000:1。所述核酸分子包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。在一些实施例中，复合物还可包括拟递送入细胞的除核酸分子之外的其它货物分子，包括人和动物疾病的预防，诊断和治疗用的任何药物制剂。一种所述用于非病毒基因载体材料的金属离子配体作为复合物的第三组分，在增强基因转染效率中的应用，方法如下：将金属离子配体，转染试剂和核酸分子混合，室温静置5-30分钟，得到复合物，用于转染各类细胞。本专利技术的优点和有益效果是：金属离子配体展现出核酸分子强结合力，与细胞膜强相互作用以及内涵体膜破碎的性能，所以具有很好的作为基因载体的应用前景。将金属离子配体简单添加入转染试剂和核酸分子体系中，操作简单，又大幅度增加了复合物的内吞效率和内涵体逃逸功能，最终转染效率得以大幅度提高，具有很好的临床应用前景。附图说明图1为一种二甲基吡啶胺类似物(DDA)的核磁谱图。图2为DDA与锌配位后的Zn-DDA的红细胞溶血比较。与DDA相比，*P<0.05。图3为分子量1.8k的聚乙烯亚胺PEI1.8k同Zn-DDA一起压缩DNA形成复合物在小鼠肉瘤细胞(S180)细胞中的绿色荧光转染图。Zn-DDA与PEI1.8k摩尔比为4:1，复合物中总材料/DNA质量比20:1。PEI25k/DNA质量比3:1。图4为PEI1.8k和PEI1.8k/Zn-DDA在总材料/DNA质量比5:1,10:1和20:1条件下在小鼠肉瘤细胞(S180)中的转染效率。横坐标下“0,1,2,4”代表Zn-DDA与PEI1.8k的摩尔比，因此“0”代表PEI1.8k/DNA复合物。商业化转染试剂PEI25k与DNA质量比3:1。与PEI25k相比，*P<0.05。图5为PEI1.8k和PEI1.8k/Zn-DDA在总材料/DNA质量比5:1,10:1和20:1条件下在大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)中的转染效率。横坐标下“0,1,2,4”代表Zn-DDA与PEI1.8k的摩尔比，因此“0”代表PEI1.8k/DNA复合物。商业化转染试剂PEI25k与DNA质量比3:1。与PEI25k相比，*P<0.05。图6为PEI1.8k和PEI1.8k/Zn-DDA在总材料/DNA质量比5:1,10:1和20:1条件下在大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)中的细胞存活率。横坐标下“0,1,2,4”代表Zn-DDA与PEI1.8k的摩尔比，因此“0”代表PEI1.8k/DNA复合物。商业化转染试剂PEI25k与DNA质量比3:1。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，并不用于限制本专利技术的范围。实施例1：含金属离子配体复合物的制备金属离子配体作为第三组分，与聚合物或脂质体中的一种或多种一起作为非病毒载体材料，包裹核酸分子和/或拟递送入细胞的其它货物分子形成复合物。1)金属离子配体：第三组分金属离子配体的配位单元包括含吡啶环类基团，咪唑环类基团和多氮环类基团,或者上述几种的混合物。本例给出五种不同的金属离子配体，分别如下所述：1、一种金属离子配体，是一种二甲基吡啶胺衍生物，经金属锌配位后得到的Zn-DDA结构式如下所示：DDA的核磁谱图如图1所示。2、一种金属离子配体，含吡啶环基团，经金属镁配位后得到的Mg-DAC结构式如下所示：3、一种金属离子配本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的复合物，其特征在于，所述复合物以金属离子配体作为第三组分，与聚合物或脂质体中的一种或多种一起作为非病毒载体材料，包裹核酸分子和/或拟递送入细胞的其它货物分子组成复合物，用于基因和药物递送。

【技术特征摘要】
1.一种用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的复合物，其特征在于，所述复合物以金属离子配体作为第三组分，与聚合物或脂质体中的一种或多种一起作为非病毒载体材料，包裹核酸分子和/或拟递送入细胞的其它货物分子组成复合物，用于基因和药物递送。2.根据权利要求1所述用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的复合物，其特征在于，所述金属离子配体由配位金属和配位单元组成；配位金属包括锌、镁、钙、铝、铁、铜、铕或钆；配位单元包括含吡啶环类基团，咪唑环类基团和多氮环类基团,或者上述几种的混合物。3.根据权利要求1所述用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的复合物，其特征在于，所述聚合物包括天然聚合物和化学合成聚合物。4.根据权利要求3所述用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的复合物，其特征在于，所述天然聚合物包括聚赖氨酸(PLL)，壳聚糖(CS)，环糊精(CD)，透明质酸(HA)及其各自衍生物，但不局限于上述天然聚合物。5.根据权利要求3所述用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的复合物，其特征在于，所述化学合成聚合物，包括聚乙烯亚胺(PEI)，聚丙烯亚胺(PPI)，聚酰胺-胺(PAMAM)，聚氨酯(PAE)，多肽，聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA)，聚二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺(PDMAPMA)，聚丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEA)，聚甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(PDEAEMA)，聚N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(PAPMA)，聚N-(2-氨基乙基)丙烯酰胺(PAEAA)，聚N-(2-氨基乙基)甲基丙烯酰胺(PAEMA)及其各自衍生物，但不局限于上述化学合成聚合物。6.根据权利要求1所述用于非病毒基因载体材料的金属离子配体构成的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭天瑛，刘帅，贾惠婷，杨吉祥，潘建萍，梁会云，曾立恒，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12