一种禽流感病毒的全悬浮培养方法技术

本发明专利技术公开了一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：步骤1：取EB66细胞进行生长培养；步骤2：待EB66细胞的密度生长至适于接毒时，采用流加补液接毒工艺向EB66细胞中接种禽流感病毒，进行病毒的增殖培养；步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的HA效价，在病毒HA效价达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的禽流感病毒。本发明专利技术用EB66细胞进行禽流感病毒培养，避免了采用传统鸡胚培养工艺生产时易引入大量杂蛋白的缺点，有效降低鸡只免疫副反应的发生，同时提高培养的禽流感病毒滴度及纯度，进而提高禽流感疫苗的生产品质。

Full suspension culture method for avian influenza virus

The present invention discloses a full suspension culture method of a bird flu virus, which comprises the following steps: Step 1: the growth of cultured EB66 cells; step 2: when the density of EB66 cells to growth for inoculation, the inoculation fluid flow and process to EB66 cells inoculated with avian influenza virus, virus proliferation culture; step 3: in 24h after inoculation, the HA titer of virus was determined by sampling every 12h, reached the highest when harvested and stored in the virus virus HA titer, cultured avian influenza virus by. The invention of avian influenza virus with EB66 cells cultured, avoiding the traditional production process of chicken embryo culture to the introduction of a large number of miscellaneous protein defects, effectively reduce the chicken immune reaction, while improving the avian influenza virus titer and purity of culture, so as to improve the production quality of bird flu vaccine.

【技术实现步骤摘要】
一种禽流感病毒的全悬浮培养方法
本专利技术涉及一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，特别涉及一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养禽流感病毒的方法，属于兽用生物制品

技术介绍
目前，已上市的禽流感疫苗大多是通过传统的鸡胚培养制得，国内外应用鸡胚进行禽流感病毒的生产己有许多年的历史。该工艺简单且技术成熟，其制备工艺主要流程为：首先将种毒液接种至鸡胚尿囊液中，鸡胚作为一个卵细胞整体，由于组织分化程度低，不会对接种的病毒产生抗体，十分有利于病毒的复制；病毒在鸡胚中培育一定时间后，通过收集鸡胚尿囊液，得到疫苗制品的中间产品；经超滤离心和浓缩后，需采用环丙内酯或甲醛灭活，再经裂解剂(如TritonX-100等)进行病毒裂解，并纯化HA和NA蛋白，最后根据HA蛋白所占比例来标定疫苗浓度。鸡胚作为病毒培养的基质，需要经过严格工序来保证其品质。首先，合格的鸡胚除了能正常生产禽流感病毒外，还应该是健康鸡群产下的受精卵，例如SPF海兰白鸡；其次，生产中一般要求产蛋鸡的年龄不超过1周年；再者，为确保鸡群在生长过程中没有感染任何禽流感等相关疾病，必须经过定期检测，同时要严格确保受精卵内不能带有任何病毒。受到这些因素的限制，导致无特定病原体(SpedficPathogenFree,SPF)的鸡胚产量小、成本高，往往不能满足大批量生产禽流感疫苗的需求。除此之外，鸡胚培养还存在诸多问题，不同批次的鸡胚质量往往存在差异，难以控制品质，而不同质量的鸡胚会对病毒培养产生不同副作用，且鸡胚的来源容易受到禽流感疫情的影响；此外，鸡胚是许多细菌的天然宿主，容易受到环境中细菌的感染，己有研究者指出由母体遗传给鸡胚所带来的潜在污染比GMP车间无菌环境中人为操作所带来的污染化率大很多，而这也正是鸡胚培养过程中难以控制的地方。另外，在鸡胚的尿囊液中含有大量动物源蛋白，在提取病毒时易被带入病毒液中，导致成品疫苗中有大量动物源蛋白，从而引起过敏反应等副作用。目前采用传代细胞系MDCK细胞作为培养基质生产禽流感病毒疫苗的技术已经越来越趋向于成熟，甚至已经达到了全悬浮大规模生产的水平，MDCK细胞虽可高密度悬浮培养，培养的禽流感病毒滴度可达到鸡胚水平，但是免疫原性与动物副反应一直是使用MDCK细胞生产禽流感病毒疫苗的技术壁垒。与鸡胚相比，同等血凝价时，采用MDCK细胞生产的禽流感病毒免疫鸡体后产生的抗体水平低，副反应严重，且MDCK细胞能在裸鼠中诱导肿瘤产生，存在致瘤的风险，导致疫苗的使用安全性较低，这对于疫苗的安全性来说是一个致命的缺点。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供用全悬浮传代细胞系EB66细胞生产禽流感H9亚型病毒的方法，该方法具有生产工艺稳定、易操作，病毒含量高、批间差异小、质量易控的优点，可显著提高疫苗产量和质量，使用该方法生产出的禽流感疫苗安全性好、免疫效力高。本专利技术的目的在于提供一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：步骤1：取EB66细胞进行生长培养；步骤2：至EB66细胞的密度生长至适于接毒时，采用流加补液接毒工艺向EB66细胞中接种禽流感病毒，进行病毒的增殖培养；步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的HA效价，在病毒HA效价达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的禽流感病毒。进一步地，所述步骤2的具体操作方式如下：待EB66细胞的密度生长至适于接毒时，取禽流感种毒对步骤1所得细胞株采用流加补液的方法进行禽流感病毒的接种，按病毒液与细胞培养基体积比进行接种，接毒完成后，将摇瓶放回5％的CO2培养箱中进行吸附，此时轨道摇床以固定的培养转速进行振荡；吸附完成后补加病毒生产液，并放回到5％CO2培养箱中继续培养，轨道摇床以固定的培养转速进行振荡；进一步地，本专利技术的全悬浮培养方法还包括步骤4：取步骤3所得培养后的禽流感病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用流加补液工艺接种至EB66细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获禽流感病毒在EB66传代细胞中适应毒。进一步地，步骤1所用EB66细胞的培养方法如下：从液氮中迅速取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，加入培养基将细胞吹打重悬均匀，接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，细胞经连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代。更进一步地，所述的EB66细胞培养温度为35℃-37℃，优选为37℃；培养转速为130rpm-150rpm，优选为150rpm。更进一步地，当EB66细胞密度达到6×106/mL-15×106/mL时，用于禽流感病毒的接种，优选的，细胞密度达到8×106/mL～10×106/mL时，用于接毒。更进一步地，禽流感病毒接毒量以体积比为主，按病毒与细胞培养基体积比为1/100/-5/100000之间接种，优选的体积比为5/10000-5/100000。更进一步地，所述的流加补液接毒，细胞接毒后吸附时间为0.5h-2h，培养温度为33℃-35℃，优选为33℃；培养转速为110rpm-140rpm，优选为120rpm。更进一步地，病毒接种吸附完成后，需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-3倍，优选为补加原工作体积1倍的生产培养基。更进一步地，病毒的培养需要补加TPCK胰酶，补加策略为接种病毒的第0天补加2mg/L，第1天再补加2mg/L或接种病毒的第0天一次性补加4mg/L，优选为第0天补加2mg/L,第1天再补加2mg/L。更进一步地，所述的EB66传代细胞培养基为CDEB66(健顺DP210)，该培养基属于无血清、化学界定培养基。进一步地，所述的禽流感病毒为A型禽流感病毒A/chicken/Gμangdong/DA/2014(H9N2)株(简称DA株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：1、本专利技术通过采用全悬浮传代细胞系EB66细胞进行禽流感病毒培养，避免了采用传统鸡胚培养工艺生产时易引入大量杂蛋白的缺点，有效降低鸡只免疫副反应的发生；同时还避免了生产基质和培养过程引入外源病毒的风险；此外EB66细胞无致瘤性，使用安全，使得通过EB66细胞所培养的病毒抗原具有更高的安全性；2、采用本专利技术培养的禽流感病毒各批间质量差异小，疫苗质量高，有效克服了疫苗大量生产受制于鸡胚供应的缺点，节省了生产成本；同时还具有生产工艺简便易操作、培养环境可控、可大规模生产等特点，具有很好的经济效益和应用前景；3、本专利技术采用了先进的悬浮培养技术，达到效果如下：(1)单位体积内细胞密度大大提高，使得单位体积培养液中的病毒含量增高，病毒滴度增加，并提高了病毒培养产量和生产效率；(2)本专利技术采用无血清全悬浮培养，无需载体和血清，大大减少产品杂质的引入，简化了产品的分离纯化过程，降低了生产难度，同时有效降低免疫后副反应的发生概率；4、本专利技术采用流加补液接毒工艺的方法，当EB66细胞密度生长至适合接毒时，进行病毒的接种，病毒吸附完成后，补加新的病毒生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：取EB66细胞进行生长培养；步骤2：待EB66细胞的密度生长至适于接毒时，采用流加补液接毒工艺向EB66细胞中接种禽流感病毒，进行病毒的增殖培养；步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的HA效价，在病毒HA效价达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的禽流感病毒。

【技术特征摘要】
1.一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：取EB66细胞进行生长培养；步骤2：待EB66细胞的密度生长至适于接毒时，采用流加补液接毒工艺向EB66细胞中接种禽流感病毒，进行病毒的增殖培养；步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的HA效价，在病毒HA效价达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的禽流感病毒。2.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，所述步骤2的具体操作方式如下：待EB66细胞的密度生长至适于接毒时，取禽流感种毒对步骤1所得细胞株采用流加补液的方法进行禽流感病毒的接种，按病毒液与细胞培养基体积比进行接种，接毒完成后，将摇瓶放回5％的CO2培养箱中进行吸附，此时轨道摇床以固定的培养转速进行振荡；吸附完成后补加病毒生产液，并放回到5％CO2培养箱中继续培养，轨道摇床以固定的培养转速进行振荡。3.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，还包括步骤4：取步骤3所得培养后的禽流感病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用流加补液工艺接种至EB66细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获禽流感病毒在EB66传代细胞中适应毒。4.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，步骤1所用EB66细胞的培养方法如下：从液氮中迅速取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡仕君，陈瑞爱，罗顺，李延鹏，温良海，张晓楠，
申请(专利权)人：华农肇庆生物产业技术研究院有限公司，肇庆大华农生物药品有限公司，甘肃健顺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44