一种新的弧菌科弧菌属菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种新的弧菌科弧菌属菌株及其应用。具体地，本发明专利技术涉及一种从海带糜烂物中分离的新的弧菌科弧菌属菌株，利用该菌株制备褐藻胶裂解酶，其产量为现有技术的２～５倍。制备的褐藻胶裂解酶可以用于制备广泛应用的褐藻胶寡糖。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物领域。具体地，本专利技术涉及一种新的弧菌科弧菌属菌株Vibrio sp.QY1，其保藏编号为CCTCC NOM 205030，以及以该菌株制备褐藻胶裂解酶和褐藻胶寡糖的应用。
技术介绍
褐藻胶是一种来源丰富、用途广泛的酸性海洋多糖，来源于褐藻和某些细菌(包括假单胞菌、固氮菌等)，由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸通过β-1，4糖苷键连接形成，可分为聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸和甘露糖醛酸与古罗糖醛酸交替嵌段。近来，褐藻胶寡糖的生物活性不断被发现，如抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗心血管疾病等，其广阔的应用前景已引起人们的广泛关注。褐藻胶裂解酶可以通过β消去机制打断褐藻胶的β-1，4糖苷键，并在非还原末端产生C4，5不饱和双键，这些还原末端不饱和双键的产生对寡糖的某些生物活性有重要影响，而物理、化学降解方法降解的产物却没有这些特性。酶法制备褐藻胶寡糖因反应条件温和易控、产物单一、不造成环境污染等特点已逐渐取代酸法。现已从细菌、无脊椎动物中分离到数十种褐藻胶裂解酶，但普遍存在着产酶量低、底物特异性差的缺点，大大限制了褐藻胶寡糖的应用。而本专利技术的专利技术人从海带糜烂物中分离到一株高产胞外褐藻胶裂解酶的海洋细菌CCTCC NOM 205030，产酶量比已报道的高出2～5倍，并从其发酵产物中分离得到一种褐藻胶裂解酶。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种新的弧菌科弧菌属菌株(Vibrio sp.QY1)CCTCC NOM 205030。本专利技术的另一目的是提供一种利用上述菌株制备的褐藻胶裂解酶。本专利技术的再一目的是提供利用上述褐藻胶裂解酶制备的褐藻胶寡糖。根据本专利技术的一个技术方案，从海带糜烂物中分离得到一种新的弧菌科弧菌属菌株(Vibrio sp.QY1)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM 205030。根据本专利技术的另一技术方案，本专利技术提供了一种通过发酵上述菌株、然后分离纯化得到的褐藻胶裂解酶，该酶的分子量为39kD。根据本专利技术的再一技术方案，本专利技术提供一种通过使用上述褐藻胶裂解酶分解褐藻胶而得到的褐藻胶寡糖。本专利技术的弧菌CCTCC M 205030能够用于褐藻胶裂解酶的生物制备，其产酶量比已报道的菌株的产酶量高出2～5倍。具体实施例方式本专利技术的弧菌科弧菌属菌株(Vibrio sp.QY1)，于2005年4月7日被保藏于中国典型培养物保藏中心(地址中国 武汉 武汉大学，邮编430072)，保藏编号为CCTCC NOM 205030。实施例1弧菌CCTCC NOM 205030的分离取海带糜烂部分1g，浸于100毫升灭菌海水中，搅拌1小时，取1毫升悬浮液接入100毫升液体培养基，25℃静止培养一周。取培养液在固体平板上划线分离单克隆，连续5代单克隆纯化培养。挑取单克隆接种到含3毫升液体培养基的试管中，25℃200r/min培养12小时。将培养液按1％的比例接入含50毫升液体培养基的250毫升三角瓶中，于25℃200r/min培养3天。培养液于4℃12000r/min离心10min去除菌体，测定上清液的酶活力，选取酶活力最高的菌株。其中一株细菌发酵产生的酶活力最高，为152U/L，将其命名为QY1。使用的液体培养基配方为(g/L)褐藻酸钠3.0g、KH2PO43.0g、K2HPO47.0g、(NH4)2SO42.0g、MgSO40.1g、FeSO40.1g、NaCl 30.0g；固体培养基中添加12.0g/L的琼脂。酶活力测定采用紫外吸收法，取0.9毫升3g/L褐藻酸钠(用0.1mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液配制)，加入0.1ml酶液，30℃保温15min，测定反应体系在235nm处的光吸收值。在此条件下，每分钟光吸收值增加0.1为一个酶活力单位(U)。实施例2弧菌CCTCC NOM 205030的鉴定1、形态特征所得菌株在常规使用的Zobell 2216E平板上培养24h的菌落呈圆形，半透明，表面光滑，边缘整齐，直径为2.5mm；在常规使用的TCBS平板上菌落呈黄色，直径为3.2mm。该菌株为革兰氏阴性，杆状，可运动。2、生长条件菌株CCTCC NOM 205030为兼性厌氧菌。CCTCC NOM 205030在1％～10％NaCl浓度范围内生长良好，最适NaCl浓度为4％，最适生长温度25℃，最适生长pH7.0。3、生理生化特征常规生化实验表明，菌株CCTCC NOM 205030氧化酶反应阳性，发酵葡萄糖产酸不产气，对弧菌抑制剂O/129(2，4-二氨基-6，7-二异丙基喋啶磷酸盐，150mg/L)敏感，不发光，不产色素。结合形态特征，初步判断菌株CCTCC NOM 205030属于弧菌科弧菌属(Vibrio sp.)。4、生物学分类位置的确定将菌株CCTCC NOM 205030的形态特征、生理生化特征与弧菌属部分细菌的特征进行了比较，结果(表1)表明，菌株CCTCC NOM 205030与灿烂弧菌(Vibrio splendidus)最接近，仅在还原硝酸盐、发光等2方面不同，与河口弧菌(Vibrio aestuarianus)在V-P产生、40℃生长、淀粉酶产生、明胶酶产生等4方面不同，与溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)在游动、精氨酸双水解酶、还原硝酸盐、V-P产生、4℃生长、肌醇发酵、溶藻酶产生等7方面不同，与双氮弧菌(Vibriodiazotrophicus)在还原硝酸盐、阿拉伯糖发酵、甘露糖发酵、乳糖发酵、水杨苷发酵、明胶酶产生、脂酶产生、几丁质酶产生等8方面不同。表1菌株CCTCC NOM 205030与弧菌属部分成员表型特征的比较 +，多于90％的菌株为阳性；-，多于90％的菌株为阴性；D，11～89％的菌株为阳性。菌株CCTCC NOM 205030为革兰氏阴性杆菌，可运动，氧化酶反应阳性，发酵葡萄糖产酸不产气，对弧菌抑制剂O/129敏感，不发光，不产色素，因此初步判断菌株CCTCC NOM 205030属于弧菌科弧菌属(Vibrio sp.)。根据该菌株与部分弧菌属细菌的生理生化特征的比较，CCTCC NOM 205030与V.splendidus最接近，但需要指出的是，在伯杰氏细菌鉴定手册(第九版)中对于V.aestuarianus有许多生理生化特征没有描述，因此CCTCC NOM 205030有可能与V.aestuarianus还有更多的异同点。实施例3褐藻胶裂解酶的制备(1)菌体培养挑取弧菌CCTCC NOM 205030的单克隆接种到含3毫升液体培养基的试管中，25℃200r/min培养12小时。将培养液按1％的比例接入含50毫升液体培养基的250毫升三角瓶中，于25℃200r/min培养3天，收集培养液。使用的液体培养基配方为(g/L)褐藻酸钠3.0g、KH2PO43.0g、K2HPO47.0g、(NH4)2SO42.0g、MgSO40.1g、FeSO40.1g、NaCl 30.0g。(2)酶的分离纯化培养液于4℃12000r/min离心10min去除菌体，收集上清液。于上清液中缓慢加入硫酸铵至80％饱和度，4℃静置3h，4℃13000g离心30min，弃去上清液，沉淀溶于20mmol/L 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新的弧菌科弧菌属菌株（Ｖｉｂｒｉｏｓｐ．ＱＹ１）ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０５０３０。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于文功，韩峰，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]