一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法技术

本发明专利技术公开了一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法，（1）肝癌大鼠构建和肝脏（2）转录组测序（3）基于iTRAQ联合LC‑MALDI的差异蛋白组学研究（4）生物信息学分析（5）RT‑PCR（6）免疫组化（7）ELISA结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性；（8）数据统计分析方法；本发明专利技术采用临床样本对其进行定位定量的表达验证，寻找其与临床相关性的证据，评价临床价值，为肝癌发病学和肝癌机制研究提供新的线索。课题筛选的肝癌关键分子将为探索与早期发现、分类、评价预后相关的肝癌标志物,以及选择更加有效、准确的肝癌治疗靶位奠定研究基础。

【技术实现步骤摘要】
一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法
本专利技术涉及基因转录组学和蛋白质组学领域，尤其是一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法。
技术介绍
在生物学及医学研究中，很重要的一个领域是对生物系统和生命进程的结构、功能及调控的观察。但在过去的几百年间，生物学家一直关注于单个基因或蛋白质在生物系统内的表达变化和功能，而不能从全局的、整体的角度来研究生命体系的变化。随着医学的进步，人们发现很多疾病，特别是癌症的发生往往是多因素、多基因、多途径协同作用导致的。这就需要一个可以全面的、动态的、系统的研究生命体系的技术和手段，于是“组学”概念应运而生[3]。但随着人类基因组计划的完成，人们发现于仅仅从基因组学的角度无法完全正确预测基因转录过程中发生的剪切、拼接以及在翻译时开放阅读框架密码子的起始、终止位置和翻译后的各种修饰情况。在基因表达研究中，广泛的基因分析可以对生理状态或者是一个细胞表型有关的基因进行系统监测，可以利用高通量分析在数据输出和获取数据快捷两方面的优势，对疾病过程中的功能候选基因进行鉴定。微阵列技术的成熟，使研究人员通过转录组测序研究，寻找感兴趣的标记基因。正如肿瘤基因表达对各种来源的组织和患者存活结果的相关性分析例子一样，通过微阵列技术进行的基因表达分析研究将在生物标记发现过程中继续扮演重要作用。尽管微阵列的分析能力很强大，转录组学研究平台只包括那些适应生长条件变化细胞的转录物。大多数细胞内和细胞间的生物化学过程都会受到蛋白质-蛋白质或者其他蛋白质-底物相互作用的影响。蛋白质组水平的基因表达分析提供了一个快速的可控制生物合成的过程，其中大部分是由转录组学平台调控的。同时，转录组本身通过表达的蛋白质或者是细胞生化状态下其他的变化，进行反馈控制。换句话说，基因表达不仅仅是从转录组到蛋白质组的单向流动，而是两者的相互连接。对这种功能调控的了解通常只限于特殊的信号途径，或者是新陈代谢途径。要了解转录组和蛋白质组之间的相互调控作用，需要对RNA和蛋白质的表达进行整体同步监测。转录组学、蛋白质组学和生物信息学研究技术的进步为研究复杂生物系统开辟了崭新的途径，将三者连接到一起的整合研究可以揭示疾病发生时从基因携带的遗传信息转变为可辨别表型的整个过程中的异常，其采集的海量信息涵盖了疾病发病学和疾病机制中的关键功能节点，可用来鉴定肿瘤相关基因及其表达的蛋白质，使得数以千计的基因和蛋白质的分析成为可能，为探索早期发现、分类、评价预后的肿瘤标志物,以及选择更加有效、准确的肿瘤治疗靶位提供了可靠的保证。新一代Ionproton测序仪采用半导体芯片技术，测序速度快，且具有极高的扩展性，通过专有的大规模并行半导体感应器，对DNA复制时产生的离子流实现直接和实时的检测。当试剂通过集成的流体通路进入芯片中，密布于芯片上的反应孔立即成为上百万个微反应体系。这种独特的流体体系、微体系机械设计和半导体的技术组合，使研究人员能够在2小时内获取从10Mb到1Gb以上的高精确度序列。此外，IonProton测序仪和IonReporter分析软件可在一台独立的服务器完成单个基因组的分析，打破了目前的数据分析瓶颈，大大降低了研究成本，提高了检测的速度和准确性，在科研和临床上均有很好的应用；到目前为止，在已发表的整合分析文章中，大多数LC-MS分析是与稳定同位素标记联合使用的，尤其是iTRAQ试剂。即便采用的技术不同，迄今为止公开发表的整合分析都指出了转录组学和蛋白组学的重要性。转录组学或蛋白组学通常只考虑调节系统和分解作用平衡态的净效应，实际上，出现的不一致性只是合成与降解两种替换过程中的一种反映，研究者对变化过程中的机制更感兴趣；此外，转录组学和蛋白组学分析要想整合成功，需要有效和精确的相互参考。研究人员需要灵活的定义自己的基因图谱，但也可能需要选择采用预定义的针对蛋白质的目标图，当新的基因组、转录组和蛋白组序列出现，研究人员需要及时注册更新，并且删除错误的信息。生物信息学技术的发展使得肿瘤生物学过程中的基因转录、表达整个过程中的异常得以揭示，为肿瘤机制研究提供了线索。本研究拟利用IonProton转录组测序和LC-MALDI差异蛋白组分析平台，开展肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析。通过构建肝癌大鼠模型，比较正常和肝癌组织中的基因转录和蛋白表达差异，对肝癌中转录组和蛋白组都出现异常的分子进行基因优化、可变剪接分析、新基因或新转录本筛选、表达量分析、差异表达分析、差异表达聚类分析和功能注释等生物信息学分析处理，筛选肝癌关键功能节点和肿瘤分子，并对其进行临床验证和临床价值评估。本研究将为肝癌发病学和肝癌机制研究提供新的线索。本专利技术一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法的技术方案，经检索国内同行业未见相同。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法。这种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法，由以下步骤组成：（1）肝癌大鼠构建和肝脏清洁级Wistar雄性大鼠40只,体重150±20g；随机分为试验组30只,对照组10只；按清洁级动物的饲养要求饲养在半屏障系统中；用灭菌的自来水配制浓度为100μgPml的二乙基亚硝胺溶液(避光保存,新鲜配制),供试验组大鼠自由饮用,每天更换一次,3个月后改为一般的灭菌自来水,继续观察2个月,整个实验过程共5个月；对照组整个实验过程均饮用灭菌自来水；实验截止时注射过量戊巴比妥钠处死动物，打开腹腔,取肝组织用10%甲醛固定，HE染色后进行病理学镜检,确定大鼠肝癌诱导完成；（2）转录组测序提取正常和肝癌大鼠肝脏总RNA,过程中注意避免RNA酶，测量OD值后确定样本浓度，分别混合正常组和肝癌组大鼠肝脏总RNA，使两个混合样本的RNA含量均在100ug以上，分离纯化mRNA,使其含量达5-400ng，构建全转录组文库，制备模板并采用Ionproton系统进行定量测序；（3）基于iTRAQ联合LC-MALDI的差异蛋白组学研究提取正常组和肝癌组大鼠肝脏总蛋白液，将两组分别混合，采用丙酮沉淀法将蛋白质沉淀后定量，使每组约含100ug总蛋白，依次进行进行胰酶酶解、还原烷基化、iTRAQ标记等，过程严格遵照iTRAQ试剂盒说明书进行；将iTRAQ标记后的正常组和肝癌组大鼠肝脏酶解产物等量混合，进行一维SCX和二维nano-LC色谱分离后，进入质谱仪分析；（4）生物信息学分析分别对转录组测序和差异蛋白组学数据进行数据覆盖度、对比信息统计等，寻找肝癌中转录和蛋白表达均显示差异的分子进行新转录本及注释、表达量分析和差异表达分析、差异表达聚类分析、差异表达基因的功能注释分析等数据挖掘工作，筛选肝癌相关关键功能节点及肿瘤分子；（5）RT-PCR根据肝癌分子的Accessionnumber，在genebank获得其序列并设计PCR引物；组织提取总RNA，逆转录成cDNA作为PCR模板；依次进行DNA变性、退火和延伸等，具体条件参照引物和试剂说明书；（6）免疫组化组织切片脱蜡、水化后PBS洗2～3次各5分钟；将3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟；PBS洗2～3次各5分钟；电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至95℃左右，放入组织片片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法，其特征在于：由以下步骤组成：（1）肝癌大鼠构建和肝脏清洁级Wistar 雄性大鼠40 只,体重150 ±20g；随机分为试验组30 只,对照组10 只；按清洁级动物的饲养要求饲养在半屏障系统中；用灭菌的自来水配制浓度为100μgPml 的二乙基亚硝胺溶液(避光保存,新鲜配制) ,供试验组大鼠自由饮用,每天更换一次,3 个月后改为一般的灭菌自来水,继续观察2个月,整个实验过程共5个月；对照组整个实验过程均饮用灭菌自来水；实验截止时注射过量戊巴比妥钠处死动物，打开腹腔,取肝组织用10 %甲醛固定，HE染色后进行病理学镜检,确定大鼠肝癌诱导完成；（2）转录组测序提取正常和肝癌大鼠肝脏总RNA,过程中注意避免RNA酶，测量OD值后确定样本浓度，分别混合正常组和肝癌组大鼠肝脏总RNA，使两个混合样本的RNA含量均在100ug以上，分离纯化mRNA, 使其含量达5‑400ng，构建全转录组文库，制备模板并采用Ion proton系统进行定量测序；（3）基于iTRAQ联合LC‑MALDI的差异蛋白组学研究提取正常组和肝癌组大鼠肝脏总蛋白液，将两组分别混合，采用丙酮沉淀法将蛋白质沉淀后定量，使每组约含100ug总蛋白，依次进行进行胰酶酶解、还原烷基化、iTRAQ 标记等，过程严格遵照iTRAQ试剂盒说明书进行；将iTRAQ标记后的正常组和肝癌组大鼠肝脏酶解产物等量混合，进行一维SCX和二维nano‑LC色谱分离后，进入质谱仪分析；（4）生物信息学分析分别对转录组测序和差异蛋白组学数据进行数据覆盖度、对比信息统计等，寻找肝癌中转录和蛋白表达均显示差异的分子进行新转录本及注释、表达量分析和差异表达分析、差异表达聚类分析、差异表达基因的功能注释分析等数据挖掘工作，筛选肝癌相关关键功能节点及肿瘤分子；（5）RT‑PCR根据肝癌分子的Accession number，在genebank获得其序列并设计PCR引物；组织提取总RNA，逆转录成cDNA作为PCR模板；依次进行DNA变性、退火和延伸等，具体条件参照引物和试剂说明书；（6）免疫组化组织切片脱蜡、水化后PBS洗2～3次各5分钟；将3% H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟；PBS洗2～3次各5分钟；电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至95℃左右，放入组织片片加热10‑15分钟进行沸热修复；PBS洗2～3次各5分钟；滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟；甩去多余液体；滴加1抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（其中，4℃过夜后需在37℃复温45分钟）；PBS洗3次各5分钟；滴加二抗（可加入0.05%的tween‑20）40～50μl，室温静置，或37℃1小时;PBS洗3次各5分钟;DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；PBS或自来水冲洗10分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；自来水冲洗10～15分钟；脱水、透明、封片、镜检；（7）ELISA用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml；在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时后洗涤（注意留出空白孔、阴性对照孔和阳性对照孔）；于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml；37℃孵育0.5～1小时，洗涤；于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟；于各反应孔中加入终止液0.05ml；结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性；（8）数据统计分析方法使用SPSS19.0统计软件包，按实际数据类型选择统计分析方法。...

【技术特征摘要】
1.一种肝癌生物学过程中的转录组和蛋白组学分析方法，其特征在于：由以下步骤组成：（1）肝癌大鼠构建和肝脏清洁级Wistar雄性大鼠40只,体重150±20g；随机分为试验组30只,对照组10只；按清洁级动物的饲养要求饲养在半屏障系统中；用灭菌的自来水配制浓度为100μgPml的二乙基亚硝胺溶液(避光保存,新鲜配制),供试验组大鼠自由饮用,每天更换一次,3个月后改为一般的灭菌自来水,继续观察2个月,整个实验过程共5个月；对照组整个实验过程均饮用灭菌自来水；实验截止时注射过量戊巴比妥钠处死动物，打开腹腔,取肝组织用10%甲醛固定，HE染色后进行病理学镜检,确定大鼠肝癌诱导完成；（2）转录组测序提取正常和肝癌大鼠肝脏总RNA,过程中注意避免RNA酶，测量OD值后确定样本浓度，分别混合正常组和肝癌组大鼠肝脏总RNA，使两个混合样本的RNA含量均在100ug以上，分离纯化mRNA,使其含量达5-400ng，构建全转录组文库，制备模板并采用Ionproton系统进行定量测序；（3）基于iTRAQ联合LC-MALDI的差异蛋白组学研究提取正常组和肝癌组大鼠肝脏总蛋白液，将两组分别混合，采用丙酮沉淀法将蛋白质沉淀后定量，使每组约含100ug总蛋白，依次进行进行胰酶酶解、还原烷基化、iTRAQ标记等，过程严格遵照iTRAQ试剂盒说明书进行；将iTRAQ标记后的正常组和肝癌组大鼠肝脏酶解产物等量混合，进行一维SCX和二维nano-LC色谱分离后，进入质谱仪分析；（4）生物信息学分析分别对转录组测序和差异蛋白组学数据进行数据覆盖度、对比信息统计等，寻找肝癌中转录和蛋白表达均显示差异的分子进行新转录本及注释、表达量分析和差异表达分析、差异表达聚类分析、差异表达基因的功能注释分析等数据挖掘工作，筛选肝癌相关关键功能节点及肿瘤分子；（5）RT-PCR根据肝癌分子的Accessionnumber，在gen...

【专利技术属性】
技术研发人员：于思创，王海云，
申请(专利权)人：南宁科城汇信息科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西,45