酶及其制备和它们在生产丙烯酸铵中的应用制造技术

一种腈水解酶，其特征在于它在ｐＨ７．０时对丙烯腈的Ｋｍ为５００μＭ或更低。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生产丙烯酸铵的酶促方法以及适用于这些方法中的新微生物和酶。丙烯酸(或其盐)通常是通过一步化学转化法从氧化丙烯制备或者通过两步转化法从丙烯腈经由丙烯酰胺硫酸盐中间体制备。该化学转化法得出的产物会含来自副反应的不需要的杂质，它包括某些二聚丙烯酸的形成，当在生产条件下产物丙烯酸处于高浓度时就会形成二聚丙烯酸。利用酰胺酶将丙烯酰胺转化为丙烯酸(作为铵盐)在文献中常有描述。起先有报道将丙烯酰胺聚合物中残余的单体杂质转化为丙烯酸铵但它还提出希望将酰胺酶用于工业上从丙烯酰胺生产丙烯酸铵。从丙烯腈通过腈水合酶制备丙烯酰胺的方法是已知的，例如描述于EP-A-307,926和Appl.Microbiol.Biotechnol.1993，40，pp.189-195中的方法。后一篇文献指示腈水合酶特别可得自紫红红球菌(R.rhodochrous)J1。EP-A-188316描述了利用腈水合酶将丙烯腈转化成丙烯酰胺。一种腈水合酶得自红球菌属(Rhodococcus)菌株S-6。WO 95/04828描述了腈水合酶，其中之一得自丛毛单胞菌属(Comamonas)NI1，它被描述为可将丙烯腈转化成丙烯酰胺。这些方法如果用于生产丙烯酸铵，就会包括两步，即生产丙烯酰胺的第一步和将它水解成丙烯酸的第二步。利用两步法通常引入两种杂质。它们是来自第一步的未反应起始原料和第一步的未反应产物(它是第二步的起始原料)。将腈转化为其相应的酸的另一种方法描述于GB1,475,540中。该转化法是通过特定的细菌株对包括丙烯腈的各种腈而进行的。这些菌株是芽孢杆菌属(Bacillus)、炭疽芽孢杆菌(Bacteridium)、微球菌属(Micrococcus)或短杆菌属(Brevibacterium)的菌株。被转化物的实例有乳腈、甘氨腈(glycinonitrile)、氨基丙腈盐酸化物、氨基-3-丙腈和α-氨基-γ-甲基硫代丁腈。我们认为，微生物进行的水解是通过产生一种腈水合酶而将腈转化为酰胺和一种酰胺酶接着将该酰胺转化为酸。希望能应用丙烯腈水解酶通过工业上便利的酶促方法一步从丙烯腈生产丙烯酸铵。应用腈水解酶将丙烯腈转化为丙烯酸铵的方法在文献中已有报道，例如EP-A-187,680、JP-B-63-2596和Appl Microbiol.Biotechnol.1990，34，pp.322-324，它们应用得自紫红红球菌J1(与描述于上述EP-A-307,926中相同的微生物)的腈水解酶，以及EP-A-444,640，它也描述了得自紫红红球菌J1的腈水解酶是优选的。在J.Bacteriol.172，9，pp.4807-4815中描述了将紫红红球菌K22用于将丙烯腈转化成丙烯酸铵的方法中。在Biotech.Appl.Biochem.，1989，11，pp.581-601中阐述了得自尖镰孢(Fusarium oxysporum)f.sp.melonis的腈水解酶作用于高达60mM丙烯腈而生产丙烯酸。Stevenson等在Biotech.and Appl.Biochem.15，283-302(1992)中描述了对由红球菌属ATCC 39484生产的腈水解酶的研究。该酶对芳族腈的水解最有效，但对很多脂族腈如丙烯腈显示小的或不显示活性。据说该酶的最佳pH为7.5，在pH5.0～9.0范围之外完全被灭活，且在40℃以上预保温被不可逆地灭活。在底物、特别是苄腈存在下还可使该酶活化。该文的作者认为这是亚单位聚集的缘故。遗憾的是应用腈水解酶的已知方法都不是工业上令人满意的。例如，在Appl.Microbiol.Biotechnol.34，1990，pp.322-324中描述的方法表明，紫红红球菌J1显示最佳活性所需的pH为7.8，在30～50℃之间被轻度灭活，而在60℃下几乎被完全灭活，被高于200mM浓度的丙烯腈抑制活性，且被形成的产物(丙烯酸铵)抑制活性。此文中没有适当数据指示由该微生物生产的腈水解酶对丙烯腈的Km值或它对丙烯酸铵的Ki值，但在上述J.Bacteriol文献中报道了紫红红球菌K22的Km值为1.14mM。在Biotech.Appl.Biochem.，1989，11，pp.581-601中报道了对丙烯腈水解酶的该值为17mM，且据报道该反应期间已形成大约4～6％的丙烯酰胺。希望在经济的方法中能获得高浓度下良好产率的丙烯酸铵。希望提供实现该目的的微生物和酶。已鉴定出具有不寻常的和特别希望的活性的腈水解酶。因而该腈水解酶可用于催化从丙烯腈生产丙烯酸铵的反应，该酶或者呈整个细胞形式或者作为提取的酶。它还可用于催化其它腈如己二腈的类似反应。一种新腈水解酶的特征在于它对丙烯腈的Km低于500μM。在本说明书中Km表示在pH7.0时测定的Km。Km的测定条件为该酶表现出Michaelis-Menten动力学时的条件。特别是我们应用下文实施例6的条件。我们进行初始实验时呈整个细胞形式的优选腈水解酶对丙烯腈的Km为30.6μM，我们预计可应用标准的技术和选择方法，例如Silman等在(1989)J.Gen.Microbiol.，135，3153-3164中描述的对酰胺酶的那些以及由Wagner(1990)Tibtech.，8，263-270描述的对乳酸脱氢酶的那些，将得到Km值高达60或100，或许300μM，以及Km值降至9.4和甚至3.8μM的腈水解酶。Km值低于500μM的该新腈水解酶主要优点在于它因此而对很低含量的腈底物有效。通常酶催化反应中应用底物的浓度约为Km的10倍。因此，应用本专利技术的新腈水解酶有可能在丙烯腈浓度为500μM或更低，甚至低到300μM，常常为40～100μM时进行从丙烯腈至丙烯酸铵的转化。这很有益，因为它可通过一种方法连续生产丙烯酸铵而使反应器中、因而丙烯酸铵产物中的丙烯腈含量为300ppm或更小。本专利技术的新腈水解酶还可用于丙烯腈底物浓度大于300ppm的方法中，以及可用于间歇法或补料分批法。本专利技术的酶低Km的另一个优点在于该酶良好的清除能力。因为腈水解酶在丙烯腈浓度很低时具有活性，所以它能从例如含残余丙烯腈的丙烯酸铵产物中清除很低浓度的残余丙烯腈。能在很低腈浓度下工作还是有益的，因为丙烯腈和其它腈在高浓度下具有使腈水解酶灭活的倾向。具有更高Km的已知酶迄今应用有限，因为它们需要一定的最小腈含量才能实现有效的反应活性，但该含量高到足以导致灭活。本专利技术的腈水解酶能有效地作用于浓度低到足以避免使该酶明显灭活的丙烯腈或其它腈而生产丙烯酸铵或其它盐。本专利技术的新腈水解酶特征在于它对丙烯酸铵的Ki至少为100mM，优选至少为150或200，更优选至少为250mM。本说明书中，Ki表示在pH7.0下测定的Ki。该酶在测定条件下表现出Michaelis-Menten动力学。优选的测定条件是下文实施例7中给出的条件。我们进行初始实验时优选的腈水解酶对丙烯酸铵的Ki据我们估测为309mM。预计标准技术和选择方法，例如诱变，将产生对丙烯酸铵的Ki高达300mM或甚至800mM或更大的腈水解酶。本专利技术的腈水解酶高Ki值的优点在于它使该酶催化丙烯腈的反应而生成高浓度的丙烯酸铵(10％ w/v或更大，例如高达30或40％)。在这类反应中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：Y·C·阿米塔吉，J·胡格斯，N·A·韦伯斯特，
申请(专利权)人：希巴特殊化学水处理有限公司，
类型：发明
国别省市：