一种检测样品中是否存在老年痴呆病基因的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种诊断和预测老年痴呆病的基因诊断方法和试剂盒，具体地，本发明专利技术提供了一种通过检测是否存在载脂蛋白Ｅε４等位基因（ＡＰＯＥ↑［＊］４基因）而检测或预测老年痴呆症的改良方法，以及相关的试剂盒。本发明专利技术具有成本低、程序简单、耗时少等优点。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测
和疾病基因诊断领域。更具体地，本专利技术涉及一种通过检测是否存在载脂蛋白Eε4等位基因(APOE*4基因)而检测或预测老年痴呆症的方法，以及用于该方法的试剂盒。近年来对Alzheimer氏病(即痴呆病的一种)的研究发现，在这些病人的大脑内存在大量异常的老年斑和嗜刚果红血管病变。虽然对这些异常组织结构的生化成分已进行了广泛研究，但它们在导致老年痴呆病中所起的作用却仍然不详。成熟的老年斑是一种复杂的结构，由淀粉样纤维丝的中心核组成，淀粉样纤维丝被营养不良的轴突、轴索末端和树突、小神经蚀质细胞和星形纤维胶质细胞所包围。老年斑淀粉样中心核是一种称为β-淀粉样蛋白(Aβ)的含40-43个氨基酸残基的多肽，周围被血管包围，从而产生嗜刚果红血管病变。通过体内实验发现，β-淀粉样蛋白多肽具有神经毒性，可在Alzheimer氏病、唐氏综合症、荷兰型遗传性脑出血和老年人大脑中发现。β-淀粉样蛋白多肽是由正常的淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein，简称为“APP”)通过裂解产生的。载脂蛋白E(ApoE)是一种在体内起很重要作用的蛋白，例如它是血浆脂蛋白的组成成分，参与胆固醇代谢，同时还是肝脏合成的极低密度脂蛋白的成分之一。ApoE蛋白主要有三种异型体，分别为ApoE2、ApoE3、ApoE4。这三种异型体是人第19号染色体一个基因位点上三个等位基因中任何两个等位基因的表达产物。存在三种纯合基因型，分别为APOE2/2、APOE3/3、APOE4/4，以及三种杂合基因型，分别为APOE2/3、APOE2/4、APOE3/4。APOE3/3是最常见的基因型。三种ApoE蛋白的氨基酸组成仅有细微的差别对于第112位和第158位氨基酸残基，ApoE3蛋白分别为半胱氨酸和精氨酸；ApoE4蛋白分别为精氨酸和精氨酸；ApoE2蛋白分别为半胱氨酸和半胱氨酸。研究发现，APOE基因和老年痴呆病存在相关性，这是一个非常了不起的研究成果，其中主要有三方面的证据(1)连锁分析基因定位法发现，第19号染色体的APOE基因区域同老年痴呆紧密关联；(2)脑脊液中ApoE蛋白同β-淀粉样蛋白多肽固定在一起；(3)在老年痴呆病人大脑神经纤维缠结和老年斑中发现了抗ApoE的蛋白。正是这三方面的有力证据，使APOE基因是老年痴呆病的危险因子这一论断得到世界上几乎所有相关实验室的认可。除了和老年痴呆病有关外，APOE基因和老年认知功能减退、冠心病、胆结石、糖尿病及动脉粥样硬化、大肠癌等也存在相关性。进一步的研究表明，老年痴呆病人中APOE*4基因频率显著高于正常老年人。根据这一原理，通过检测到受试人是否含有APOE*4基因，就可辅助诊断病人可能患老年痴呆或告诉阳性受试人应注意预防老年痴呆。检测是否是APOE*4基因纯合子或杂合子的方法有两类，它们分别在核酸水平上直接地或在蛋白水平上间接地进行检测，因而分别称为直接法和间接法。直接法主要是使用基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增的限制性内切酶法，直接做基因分型；间接法是通过用等电聚焦法分离ApoE蛋白，再用抗ApoE4蛋白的抗血清进行鉴定，从而间接推测受试人的基因型。用等电聚焦分离法及抗体结合显色反应来间接地进行APOE基因分型是较早的方法。等电聚焦分离法的原理是蛋白质分子的等电点(pI)不同。ApoE2、ApoE3和ApoE4蛋白的等电点分别为5.9、6.0和6.1，所以不同等电点的ApoE蛋白在连续pH梯度的凝胶中的电泳迁移速率不同，因而可以得到有效的分离。分离出蛋白质之后，通过半干电转移法将蛋白质转到固体支持膜上，然后按标准的Western印迹法，分别用特异的抗ApoE蛋白抗体进行结合测定而作出鉴定。等电聚焦-抗体法是较早使用的方法，由于操作复杂、步骤多、价格昂贵而日渐被PCR-限制性内切酶法(PCR-RFLP)(也称为“基于PCR扩增的限制性内切酶法”)所淘汰。在直接检测受试人体内APOE基因型的直接法中，有其它多种方法可用于替代基于PCR扩增的限制性内切酶法，其中包括例如可被检测的标记寡核苷酸探针杂交法、连接酶链反应、链取代扩增法、逆转录扩增法、自主维持序列复制法、核酸序列扩增法、复制链反应法等。比如，在前述的APOE基因的“可被检测的标记寡核苷酸探针杂交法”检测技术中，可用特异结合到APOE*4基因的一个、一对或两对探针来检测是否含APOE*4基因(即基因型为APOE2/4，APOE3/4和APOE4/4)，而该探针在相同的条件下不会和APOE*2、APOE*3基因(即基因型为APOE2/2，APOE3/3和APOE2/3)结合。类似地，可用特异结合到APOE*2基因的探针来检测是否含APOE*2基因；用特异结合到APOE*3基因的探针来检测是否含APOE*3基因。综合使用这些探针，就可以确定受检测对象或样品中APOE的基因型。然而，标记寡核苷酸探针杂交法有以下缺点成本高，操作条件难以控制。目前，基于PCR扩增的限制性内切酶法是较为理想的进行APOE基因分型的检测方法。PCR扩增反应可以按常规方法进行。典型的PCR反应包括三个步骤(1)高温热变性，将待检测样品中的模板DNA双链解成单链；(2)退火反应，让一对特异引物分别同模板DNA 5’和3’末端按碱基互补配对原则紧密结合；(3)延伸反应，在热稳定的高温聚合酶的催化作用下，分别将四种游离碱基(A、T、G和C)根据模板的序列按碱基互补配对原则合成两条互补的双链DNA。一般经过30-35个循环，可将长2kb的DNA从原来的1pg扩增到0.5-1μg，。通常，这种含量已足够做进一步的分子生物学实验。通过PCR反应对各种APOE基因型进行扩增之后，可以用特异的探针、限制性内切酶酶切、变性梯度凝胶或现有的其它可行技术来做基因分型。Wenham等在The Lancet 1991.3371158-1159发表了通过限制性内切酶酶切技术进行APOE基因分型方法。在该方法中，扩增出的PCR产物覆盖了APOE基因中编码第112和158位氨基酸残基的多态性位点，PCR产物长度是227碱基对，扩增后用限制性内切酶CfoI酶切扩增产物，然后用20％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切片段，由于6种APOE基因型酶切产物长度不同，所以可以进行准确的基因分型。Hixon等人的方法(J.Lipid Res.1990.31545-48)同Wenham等人的方法相差无几，差别仅在于因所用的引物不同而导致扩增出的PCR产物长度不同，Hixon等人的长度为244碱基对。Hixon等人和Wenham等人的检测方法虽然可以准确地进行APOE基因分型，但是仍存在一些明显缺点，如成本高，耗时长。因此，本专利技术的目的是提供一种改进的检测APOE*4基因的方法，该方法的成本更低和/或耗时更短，同时检测精确度维持不变或更高。本专利技术的另一目的是提供一种用于检测APOE*4基因的试剂盒。在本专利技术的一个方面，提供了一种检测样品中是否存在APOE*4基因的方法，它包括步骤(a)用样品制备PCR反应模板；(b)用检测APOE*4基因的特异性引物和步骤(a)中模板，在特异性扩增条件下进行PCR扩增；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中是否存在ＡＰＯＥ↑［＊］４基因的方法，它包括步骤：（ａ）用样品制备ＰＣＲ反应模板；（ｂ）用检测ＡＰＯＥ↑［＊］４基因的特异性引物和步骤（ａ）中模板，在特异性扩增条件下进行ＰＣＲ扩增；（ｃ）对步骤（ｂ）的ＰＣＲ扩增产 物进行酶切；（ｄ）对步骤（ｃ）的ＰＣＲ酶切产物进行电泳；（ｅ）根据步骤（ｄ）的电泳结果判断ＡＰＯＥ↑［＊］４基因的存在与否，其特征在于，在制备模板的步骤（ａ）中，当样品为组织样品时，蛋白酶的用量为３０－７５μｇ／ｍｌ；当样品为抗 凝血或血块样品时，蛋白酶的用量为０－５０μｇ／ｍｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贺林，张建刚，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究中心，中国科学院上海脑研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]