一种水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法。所述检测方法包括如下步骤：S1：在含有抗性代谢物Arabidopsides的水稻样品中加入氯仿，振荡使样品溶解充分、过滤得滤液；S2：在滤液中加入甲醇和乙酸铵得混合溶液；S3：以标准品为对照，运用高效液相色谱与质谱联用技术，对样品中Arabidopsides进行梯度洗脱、分离、检测和定量分析。本发明专利技术提供的检测方法，可使Arabidopsides在较短时间内洗掉杂质，更好地分离待测组分，缩短分析检测时间，更灵敏地捕捉到Arabidopsides，实现分离，高效、精准地对Arabidopsides进行定性与定量。

A method for the detection of resistant metabolite Arabidopsides in Rice

The present invention relates to a method for detection of resistant metabolite Arabidopsides in rice. The detection method comprises the following steps: S1: adding chloroform in rice samples containing resistant Arabidopsides metabolites, oscillation to dissolve the sample fully, filtering to obtain filtrate; S2: mixed solution with methanol and ammonium acetate in the filtrate; S3: the standard, coupled with high performance liquid chromatography and mass spectrometry., the gradient elution and separation, detection and quantitative analysis of Arabidopsides in the sample. The method provided by the invention, Arabidopsides can be washed in a relatively short period of time impurities, better separation of analytes, shorten the detection time, more sensitive to Arabidopsides, realize the separation efficiency, precision of Arabidopsides qualitative and quantitative.

【技术实现步骤摘要】
一种水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法
本专利技术属于植物代谢物领域，具体涉及水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法。
技术介绍
植物代谢分为初生代谢和次生代谢，次生代谢物由初生代谢派生的一类特殊的代谢产生的物质。次生代谢物被发现与植物的抗病、抗逆相关，在调控植物对生态环境的适应性方面起着重要的作用，氧化脂类物质就是这些代谢物中极为重要的一类。氧化脂类包括OPDA（12-oxo-phytodienoic-acid，12-氧—植物二烯酸）、JA（jasmonate，茉莉素）和Arabidopsides等等。Arabidopsides是单半乳糖甘油酯或双半乳糖甘油酯的衍生物，由MGDG或DGDG分别于与两到多个OPDA或dnOPDA组成的化合物。目前已发现的Arabidopsides有7种（ArabidopsideA、ArabidopsideB、ArabidopsideC、ArabidopsideD、ArabidopsideE、ArabidopsideF和ArabidopsideG）。研究表明，Arabidopsides与OPDA同是重要的植物信号分子，可调控一些植物基因的表达，尤其是在植物本体受到外界伤害或者病原体入侵时，Arabidopsides也可引发防御基因起到保护植物体的作用，与JA信号途径紧密相关。目前有研究表明，随着植物年龄的增长，Arabidopsides的相对含量降低，推测Arabidopsides可能参与调控植物的衰老。水稻（OryzasativaL.）是世界范围内最重要的粮食作物之一，并且是单子叶植物研究的模板。因此研究水稻的生长发育，及其对逆境的抗性响应机制，关系着国家的农业发展与经济增长以及全世界人民的生活质量，具有显著的理论意义和实用价值。通过检测水稻植株的内源Arabidopsides的水平，可丰富对JA调节机制的认识，为水稻在防御病虫害方面的改善与进步提供了坚实的理论基础。在器官、组织乃至细胞水平对Arabidopsides进行准确测定是了解其调控植物生长发育功能的前提，同时，对Arabidopsides的定性与定量分析，为OPDA、Arabidopsides与JA间的作用研究、多种激素网络调节的功能研究提供了基础。目前多项研究提及的植物代谢物的测定方法中，大部分通过萃取和色谱分离进行分离、提纯从而提高样品待测物质的含量，运用放射免疫法、紫外或荧光的方法检测植物代谢物。但以上方法程序繁琐、耗时多、耗材量大、测量结果精确度不高。因此，开发一种高效且精确可靠的检测方法具有重要的研究意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中植物代谢物的测定方法低效和精确度不高的缺陷，提供一种水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法。本专利技术的提供的检测方法可高效、精准的实现水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：S1：在含有抗性代谢物Arabidopsides的水稻样品中加入氯仿，振荡、溶解充分、过滤得滤液；S2：在滤液中加入乙醇和甲醇铵得混合溶液；S3：以标准品为对照，运用高效液相色谱与质谱联用技术，对样品中Arabidopsides进行梯度洗脱、分离、检测和定量分析；其中，流动相A为甲醇、乙腈、水和挥发性酸的混合溶液，所述流动相A中甲醇、乙腈和水的体积比为42.5:42.5:15；流动相B为异丙醇和挥发性酸的混合溶液；所述抗性代谢物Arabidopsides包括ArabidopsideB和/或ArabidopsideF。采用本专利技术的检测方法，运用梯度洗脱过程可以使Arabidopsides在较短时间内洗掉杂质，更好地分离待测组分，缩短分析检测时间，更灵敏地捕捉到待测物质的子离子碎片、更精准地对水稻中Arabidopsides进行定性与定量。优选地，S2混合溶液中氯仿、甲醇和乙酸铵的体积比为300:665:35。优选地，所述流动相A和流动相B中挥发性酸为甲酸或乙酸，所述挥发性酸的体积分数为0.1%。优选地，质谱中离子对Arabidopsides/OPDA/dnOPDA为：ArabidopsideA:773.5/291.1/263.1；ArabidopsideB:801.5/291.1/263.1；ArabidopsideC:935.5/291.1/263.1；ArabidopsideD:963.5/291.1/263.1；ArabidopsideE:1047.5/291.1/263.1；ArabidopsideF:759.5/291.1/263.1；ArabidopsideG:1075.5/291.1/263.1。待检测成分通过色谱柱洗脱分离，在质谱系统中被电离雾化，而后收集检测。本专利技术根据标准品在同等条件下的电离效果、主要子离子碎片的大小和出峰时间信息，确认质谱采集样品待测物质的信息时主要收集的时间和子离子碎片的大小，从而对离子对进行优选，实现高效、精确的检测。优选地，所述梯度洗脱条件为：0～10分钟，50%～80%流动相B；10～25分钟，80%～100%流动相B；25～30分钟，100%流动相B；30～40分钟，50%流动相B。优选地，S3中色谱柱为PhenomenexKinetexC18。优选地，S3中质谱系统为ABSCIEXTripleTOF®5600+质谱系统。优选地，质谱的参数设置为：雾化气：55psi；辅助气：55psi；气帘气：35psi；离子源温度：300℃；电压：4500v。优选地，S1中选用口径为0.22微米的尼龙膜进行过滤。优选地，所述含抗性代谢物Arabidopsides的水稻样品的提取方法如下：S1：取新鲜水稻叶片碾碎后，用锡箔纸包住，置于水中；S2：过滤后向水稻叶片中加入甲醇和抗氧化剂的混合物得混合溶液。S3：向S2的混合溶液中加入提取剂，摇匀，抽提得有机相；S4：吹干有机相即得含抗性代谢物Arabidopsides的水稻样品。优选地，所述S2中水稻叶片与混合物的体积比为1:25。优选地，所述抗氧化剂为2,6一二叔丁基对甲酚、没食子酸丙酯、叔丁基对羟基茴香醚或二丁基羟基甲苯中的一种。优选地，所述混合物中抗氧化剂为体积分数为0.025%的2,6一二叔丁基对甲酚。优选地，所述S1中新鲜水稻叶片为褐飞虱处理过的新鲜水稻叶片。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法，利用特定的流动相，通过梯度洗脱方式可灵敏地捕捉到Arabidopsides，实现Arabidopsides的分离，高效、精准地对Arabidopsides进行定性与定量。附图说明图1为水稻Arabidopsides在褐飞虱处理前后的含量分析。具体实施方式下面结合实施例进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本专利技术的基础上所做的任何非本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：S1：在含有抗性代谢物Arabidopsides的水稻样品中加入氯仿，振荡使样品溶解充分、过滤得滤液；S2：在滤液中加入甲醇和乙酸铵得混合溶液；S3：以标准品为对照，运用高效液相色谱与质谱联用技术，对样品中Arabidopsides进行梯度洗脱、分离、检测和定量分析；其中，流动相A为甲醇、乙腈、水和挥发性酸的混合溶液，所述流动相A中甲醇、乙腈和水的体积比为42.5:42.5:15；流动相B为异丙醇和挥发性酸的混合溶液；所述抗性代谢物Arabidopsides为Arabidopside B和/或Arabidopside F。

【技术特征摘要】
1.一种水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：S1：在含有抗性代谢物Arabidopsides的水稻样品中加入氯仿，振荡使样品溶解充分、过滤得滤液；S2：在滤液中加入甲醇和乙酸铵得混合溶液；S3：以标准品为对照，运用高效液相色谱与质谱联用技术，对样品中Arabidopsides进行梯度洗脱、分离、检测和定量分析；其中，流动相A为甲醇、乙腈、水和挥发性酸的混合溶液，所述流动相A中甲醇、乙腈和水的体积比为42.5:42.5:15；流动相B为异丙醇和挥发性酸的混合溶液；所述抗性代谢物Arabidopsides为ArabidopsideB和/或ArabidopsideF。2.根据权利要求1所述水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法，其特征在于，S2混合溶液中氯仿、甲醇和乙酸铵的体积比为300:665:35。3.根据权利要求1所述水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法，其特征在于，所述流动相A和流动相B中挥发性酸为甲酸或乙酸，所述挥发性酸的体积分数为0.1%。4.根据权利要求1所述水稻中抗性代谢物Arabidopsides的检测方法，其特征在于，质谱中离子对Arabidopsides/OPDA/dnOPDA为：ArabidopsideA:773.5/291.1/263.1；ArabidopsideB:801.5/291.1/263.1；ArabidopsideC:935.5/291.1/263.1；ArabidopsideD:963.5/291.1/263.1；ArabidopsideE:1047.5/291.1/263.1；Ar...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖仕，张雪，戴阳朔，俞陆军，陈武，曾静，
申请(专利权)人：中山大学，湖南唯创前沿科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44