来源于鸭跖草黄斑驳病毒和木薯叶脉花叶病毒的嵌合表达启动子制造技术

本发明专利技术涉及包含至少一个得自包含植物维管表达启动子区的第一植物启动子的核酸序列的嵌合启动子，所述植物维管表达启动子区被得自第二植物启动子的核酸序列取代并包含植物绿色组织表达启动子区。本发明专利技术还涉及这些启动子的制备方法，以及含有它们的表达盒、载体、和转基因植物以及种子。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】〔说明〕本专利技术涉及嵌合表达启动子，特别是打算用于植物生物工程领域的。一般说来，表达启动子是生物工程和遗传操作领域中众所周知的。更具体就植物生物工程而论，编码希望在宿主细胞中产生的多肽的基因的表达率常常取决于所用的启动子。与此相关的问题是常用的各种启动子常常只是因为它们的组织特异性或表达强度而限于特定的应用或组织。例如可能列举的是花椰菜花叶病毒启动子35S，它与例如来源于nos基因的启动子相比是相对较强的启动子，这两种启动子都更特定地用于植物生物工程领域。因此，需要能够克服现今已知的启动子应用中的上述缺点的新的启动子。在以WO97/48819号公布的PCT申请中已报道了解决该问题的一种尝试，它描述了得自木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)的启动子，整个启动子包含一部分具有与该申请书中提到的参比序列的同源性至少为80％的18个连续核苷酸的核酸序列。除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中所用的表达方式具有以下含义-“核酸”是指DNA或RNA；-“核酸序列”是指从5’末端朝向3’末端阅读的核苷酸碱基的单链或双链低聚体或多聚体，它包括自我复制型质粒、基因、感染或非感染性DNA或RNA聚合体以及功能或非功能性DNA或RNA。在本申请所用的核苷酸符号标示中，除非另有说明，否则单链核苷酸序列的左手末端一定是5’末端；-“衍生核酸序列”是指从某序列例如通过一个或多个核苷酸的置换、缺失、添加、突变、断裂和/或合成而直接或间接得到的序列；-“启动子”或“启动子核酸序列”是指翻译起始密码子的核酸上游区，它直接参与识别和结合RNA聚合酶以及转录所需的其他蛋白质；-“植物启动子”是能够在植物细胞中引发转录的启动子；-“组成型启动子”是能够在生物体的整个发育过程中在该宿主生物体的所有或基本上所有组织中表达操作性连接的核酸序列的启动子；-“组织特异性启动子”是能够在宿主生物体的某些特定组织中选择性表达与所述启动子操作性连接的核酸序列的启动子；-“操作性连接”是指将启动子与编码要产生的多肽的核酸序列或基因连接，使得该启动子真正驱动所述连接核酸序列的转录。应当理解，该启动子序列也包括位于转录起始位点和翻译起始密码子之间的转录序列；-“表达盒”是指能够指导编码要在与所述序列相容的宿主生物体中产生的多肽的核酸序列或基因的表达的核苷酸序列。这种表达盒至少包括一个启动子和转录终止信号，以及可选的用于表达或表达所需的其他因子；-“载体”是指表达系统，例如用DNA包被的发射物、基于核酸的转运载体、适于传递核酸的核酸分子、和自我复制型自主环状DNA，例如质粒、粘粒、噬菌粒等等。当重组微生物或细胞培养物描述为表达载体的宿主时，这还可包括环状染色体外DNA(诸如象线粒体或叶绿体DNA)，已整合到宿主的染色体中的DNA，或者作为整合到宿主基因组中的自主结构在有丝分裂期间由细胞稳定复制、或者保持在宿主的核或胞质中的载体；-“质粒”是指能够在细胞中复制的自主环状DNA分子，包括称为“表达质粒”的质粒和称为“非表达质粒”的质粒。当重组微生物或细胞培养物在本申请中描述为“表达质粒”的宿主时，这是指环状染色体外DNA分子和已整合到宿主染色体中的DNA分子。若质粒保持在细胞宿主中，该质粒或者作为自主结构在有丝分裂期间由这些细胞稳定复制，或者整合到宿主基因组中；“异源序列”或“异源核酸序列”是指来源于对其天然环境来说是外来的来源或种的序列，或者若是来自相同环境，则已对其原始天然形式进行了修饰。可以对核酸序列进行修饰，例如通过用限制酶处理核酸，以产生能够操作连接到启动子的核酸片段。修饰也可以用诸如位点特异性诱变或定点诱变等技术进行；-“箱”是指赋予调节功能的核酸序列；-“…样”是指该术语提到的箱和/或核酸序列包含某些与已知参比箱和/或核酸序列相同的序列或共有序列，优选与参比序列至少50％的序列同一性，甚至更优选至少75％的序列同一性，首选至少90％的序列同一性。序列同一性百分数是在至少6个邻接核苷酸碱基的比较窗口的基础上计算出的。可以使用序列对齐算法来确定比较窗口，以确定与参比序列的同源性，例如局部同源性算法、同源性对齐算法和相似检索算法，这些算法也有电子或计算机化形式，名称为GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。序列同一性百分数通过比较参比序列与箱和/或核酸序列得到；-“位于”是指鉴定元件核酸序列上的位置，诸如“箱”、限制酶部位或具有特定功能的密码子。给出的位置用在核酸序列中该元件的起始位置数指示，是以核酸序列的读框方向来说的，也就是说，除非另有说明，否则绝大多数是从5’向3’方向；-“转基因植物”是指用基因操作技术得到的植物，包括由此得到的完整植物、它们的后代、以及用这些技术得到的生命植物器官，例如根、茎和叶。本专利技术的转基因植物可以有不同的倍性水平，特别可以是多倍体、二倍体和单倍体；-“繁殖体”是指由此可能再生完整植物的植物细胞的有结构或无特定结构的集合或装配或联合体，例如外植体、愈合组织、茎、叶、根、插枝、甚至是种子。本专利技术的申请人采用了与前面所讨论的PCT专利申请的申请人所用的不同方法。的确，本专利技术申请人已奇迹般成功地生产了能够满足并实现前述要求的嵌合启动子，尤其是相对现有的常用启动子来说，能够增加编码要在宿主细胞中、更特别是在植物细胞或再生植物中产生的多肽的基因或核酸序列的表达率的嵌合启动子。另外，为了能够选出最适合所面对的任务或应用以及将要进行工作的环境的启动子，申请人还成功地生产了一族完整的启动子，并因此使得有可能在一定程度上控制要表达的编码要产生的多肽的基因的表达率。所以，本专利技术的一个目的是包含至少一个得自包含植物维管表达启动子区的第一植物启动子的核酸序列的嵌合表达启动子，所述植物维管表达启动子区被得自第二植物启动子的核酸序列取代并包含植物绿色组织表达启动子区。优选地，第一植物启动子来源于鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)，而第二植物启动子来源于木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)。更优选地，启动子核酸序列来源于第一启动子和第二启动子的基因间隔区。在特别优选的实施方案中，嵌合表达启动子包含至少部分SEQ.ID.No.01所述的核酸序列，该序列与至少部分SEQ.ID.No.02所述的核酸序列融合。在更优选的实施方案中，本专利技术的嵌合启动子选自SEQ.ID.No.03、SEQ.ID.No.04、SEQ.ID.No.05、SEQ.ID.No.06和SEQ.ID.No.07所述的核酸序列。按照本专利技术的另一个目的，申请人发现有可能从病毒来源的基础启动子开始生产特别具有活性的嵌合表达启动子，其部分由能够促进植物绿色组织表达(GT)的外源元件组成。优选地，外源GT启动子元件也是病毒来源的。此外，按照本专利技术此方面的优选实施方案，病毒来源的启动子来源于鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)。优选地，外源启动子元件来源于木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)。更优选的是，外源GT元件置换能够促进病毒来源的启动子的维管组织表达(VT)的内源元件。按照上文中提到的先前确定的本专利技术目的的优选实施方案，该嵌合启动子还包含至少一个“胚乳样”箱，更优选包含4至10个“胚乳样”箱，首选包含6个“胚乳样”箱。按照另一个优选实施方案，该启动子还包含至少一个与植物绿色组织GT启动子元件操作性连接的“本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含至少一个得自包含植物维管表达启动子区的第一植物启动子的核酸序列的嵌合表达启动子，所述植物维管表达启动子区被得自第二植物启动子的核酸序列取代并包含植物绿色组织表达启动子区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：I朗塞，V格鲁伯，M泰森，
申请(专利权)人：默里斯坦治疗公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]