用于评估种子纯度的DNA标记和应用DNA序列评估种子纯度的方法技术

本发明专利技术涉及对水稻ＷＡ细胞质雄性不育系专一的ＤＮＡ标记，利用这种ＤＮＡ碱基标记来评估种子纯度和为了确保水稻细胞质雄性不育系的纯度的一种方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用DNA序列作为评估种子纯度的方法，尤其涉及具有同源性的DNA序列和水稻的线粒体DNA，其对于含有水稻细胞质雄性不育系的野生败育(WA)的细胞质是特有的，且在聚合酶链式反应(PCR)检测中应用这些序列去区别水稻的雄性不育系(CMS)和它们的同族雄性可育保持系。本专利技术涉及利用DNA碱基标记确保水稻细胞质雄性不育系的纯度的一种方法。杂种优势是在两个近亲繁殖系的一个杂交的后代比它双亲中的任一个有高的生产潜力的一种现象。杂种能产生比最好的品系高10-30％的产量，而且对于增加产量它也是一个受欢迎的选择。在世界上水稻是主要的禾谷类作物，而且在亚洲的许多地区它是饮食的主要部分。据估计，在亚洲的许多国家，象印度，到2025年为止，水稻的产量必须加倍才能满足日益增长的人口需要。就象在中国所证明的那样，在中国，几乎水稻种植面积的50％都是被杂种覆盖。杂种水稻的广泛种植对于增加产量是一个理想的可行的选择。相比之下，在象印度这样的国家，杂交水稻的种植面积不到水稻总的种植面积的1％。这证明了增加杂交水稻种植面积的巨大的潜力，而且，人们预计，杂交水稻种子的市场在许多种植水稻的国家将增加，这包括印度。对于杂交水稻的生产应用最广泛的系统是三系杂交系统(表1)。三系杂交系统包括1、一个被称做细胞质雄性不育系(CMS)的雄性不育的雌性可育系，因为它在基因组的细胞质成分中携带有一个给予它突变的雄性不育；2、保持系；以及3、恢复系。保持系和恢复系是雄性可育和雌性可育的。CMS和保持系与基因组的细胞核的成分实际上是完全相同的(常常作为等同-细胞核系被提到)，但是基因组的细胞质的成分是互不相同的。CMS系的雄性不育是母性遗传的，而且最有可能是由于在线粒体DNA上突变。CMS系(雌性可育)可通过用来源于保持系的花粉受精被繁殖。因为基因组的细胞质不能通过花粉进行转移，这样杂交的后代将仅仅遗传有来源于CMS系的细胞质，而且将因此是雄性不育的。即使后代基因组的细胞核成分有一半来源于保持系，由于在这两个系的基因组的成分没有什么区别，后代基因组的细胞核成分同CMS系的细胞核成分也是完全相同的。在CMS系和另一个近亲繁殖的亲本系杂交中产生的杂种种子被称做恢复系，就象上面所指明的那样是雄性可育和雌性可育的。在这个杂交中，CMS系作为雌性的亲本起作用，而恢复系是作为雄性的亲本。恢复系在其细胞核基因组中带有一个Rf基因/或多个Rf基因(可育的恢复)，它将恢复细胞质源于CMS系遗传的植物的雄性可育性。因此，在如附图说明图1所示的杂交中产生的杂种的种子是可育的。CMS和恢复系要恰当地选择，这样杂交呈现充分的杂种优势(杂种优势)以得到比近交的品种实际上更高的产量。目前在世界上具有商业价值种植的杂交水稻的绝大多数(90％或更多)是从一个单一的资源衍生它们的细胞质，这种细胞质被称作野生败育(WA)细胞质，是在中国的野生稻中被发现的。随后，利用循环的亲体做为雄性供体，通过重复回交使这个细胞质同几种不同细胞核遗传背景进行杂交。在这个方法里，几个不同的CMS系已被培育。它们中每一个都按顺序同不同的恢复系杂交而培育出大量的杂种，它们所有都具有相同的WA细胞质。保持杂种的纯度是重要的，因为任何杂质都会降低期望的产量。据估计，在杂种种子中每1％的杂质会使产量降低达100kg/公顷。印度种子法规定杂交水稻期望的纯度应该是98％(Verma，1996.Seed Tech.News 241-4)。在中国杂交水稻的纯度被规定至少是96％(Wengui Yan，2000.，US Patent#6066779)。为了确保杂交种子纯度要求的水平，用于杂交种子生产的亲本系应有高的纯度(几乎99％)水平。一个最常见的出现在杂交种子生产期间的杂质是CMS系种子中的保持系杂质。因为它们都是等同细胞核系，除了雄性不育仅在开花期能被判断，基于形态上的标准去区分这些系是极其困难的。区分CMS和保持系的DNA标记可能被研究开发和被应用在苗的水平上去进行做为杂质出现在CMS系的原种中保持系种子的实际检测。基于聚合酶链式反应基础上的DNA标记对于这个目的是极其适用的。因为它们比基于限制性片段长度多态性的方法基础上的杂交能更为有效地处理大量的样品。聚合酶链式反应是基于应用短寡聚核苷酸序列做为引物的DNA序列的酶扩增的基础上的，这样的DNA序列出现在两个结合在靶DNA位点适当间隔的引物之间。当寡聚核苷酸引物在已知靶DNA序列的基础上被设计时，PCR工作是重复的。基于的短的(8-10个碱基长)，随机设计的寡聚核苷酸引物的PCR的程序已被研究开发。这些引物不是以已知的靶DNA序列为基础的，而且包含有大量的这些随机产生的引物的试剂盒现在都已商品化供应。用这种方法被研究开发的DNA标记就是被称为随机扩增多态(RAPD)DNA标记。由于大量的引物是可用的，即使是极其相关的品系，其遗传(基因)的多态性也可以用这种方法检测。然而，RAPD标记的重复性是不好的，这是由于RAPD的寡聚核苷酸引物长度短，也可能是由于对靶特异性的要求程度的缺乏。这严重限制了RAPD标记做为一种区分不同基因型的诊断标记的实际应用。用于区分水稻CMS(WA细胞质)和保持系的RAPD标记，曾有过报道(Jena和Pandey 1999；Hybrid Rice Newsletter，213-14)。然而，由于这些标记的低可重复性使在实际中不可能应用它们以常规方法对CMS和保持系进行区分。因此，基于这些方法基础上的可重复PCR的研究开发是必要的，且其能被应用于区分CMS和保持系，如果寡聚核苷酸引物是基于在CMS和保持系之间的具有多态性的水稻DNA一个区域已知序列的基础上的，那么可能获得理想的重复水平。因为这些引物在长度上比用在RAPD分析上的引物长且对靶DNA序列特异，所以基于这样引物基础上的PCR检测将是高度可重复的。在本申请中，对于含有野生败育型细胞质(WA)的CMS水稻系特异的水稻线粒体DNA一个区域的序列确定和识别进行了描述。在这个序列基础上，可以被用于在PCR检测中区分CMS系(WA)和与它等同细胞核保持系的特异的寡聚苷酸引物已被研究开发。这些引物已被用于区分几种不同的水稻CMS系(所有均含有WA细胞质)和它们同源的保持系。在一个编代码试验中，这个检测被用于预测水稻CMS(WA)保持系混合物的基因型，其具有100％的准确性。因此育种者可以应用这个检测去成功地检测在CMS系的原种种子中保持质的杂质，确保了这个亲本系及其由它衍生的杂种纯度。在CMS系的原种种子中另一个杂质的来源是由不是指定保持系的水稻花粉杂交引起的。对于水稻CMS系的繁殖，规定的最小隔离距离为300米，在这个距离内除了保持系(优先的花粉供体或雄性亲本)外，没有其它品系的水稻被培育，这是基于来源于这个距离以外的正在生长的水稻的花粉不能传粉给雌性亲本的观察为基础的。偶尔，这个最小的隔离距离或者没有被严格遵守或者由于当地的条件(例如风流和天气)可能允许花粉从正在生长的水稻作物上被转移到300米以外的距离。因此，监测在CMS繁育期间出现的劣种花粉供体远源杂交的程度是重要的。在本专利中，描述了象微卫星和序列标签位点(STSs)这样用于估计在CMS系的原种种子繁育期间出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个实质上和水稻线粒体ＤＮＡ同源的ＤＮＡ序列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３），所述序列对于水稻的含有细胞质雄性不育的野生败育细胞质是特有的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：亚什陶拉贾米尔，拉梅什V松迪，
申请(专利权)人：科学与工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：IN[印度]