一种鸡肌内前体脂肪细胞的分离、培养及诱导分化方法技术

本发明专利技术涉及一种鸡肌内前体脂肪细胞的分离、培养及诱导分化方法，属于细胞学技术领域。本发明专利技术的方法使用激素混合物3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤、地塞米松和胰岛素，添加外源油酸及罗格列酮的诱导分化体系，诱导鸡肌内前体脂肪细胞油滴的发生，能够为家禽肉品质，特别是禽类肌内脂肪沉积方向，提供一种有效的研究手段。采用本发明专利技术方法可获得成分均一、增殖和分化旺盛的肌内前体脂肪细胞，并得到一种高效的鸡肌内脂肪细胞诱导分化体系，本发明专利技术的方法具有简捷、易操作、廉价且获得细胞数量多、活力高、增殖分化能力强的特点。

Isolation, culture and differentiation of a chicken intramuscular precursor adipocyte

The invention relates to a method for separating, cultivating and inducing differentiation of a chicken intramuscular precursor adipocyte, which belongs to the technical field of cytology. The method of the invention uses the hormone mixture of 3 1 isobutyl methylxanthine, dexamethasone and insulin, the differentiation system added exogenous oleic acid and rosiglitazone, induce preadipocyte droplets of the chicken muscle, to poultry meat quality, especially the direction of intramuscular fat deposition in poultry, provide a kind of effective research means. The method of the invention can obtain homogeneous, proliferation and differentiation of strong intramuscular preadipocytes, and get a fat cell differentiation system, chicken muscle, the method of the invention is simple, easy to operate, cheap and features of cell number and activity, proliferation differentiation ability.

【技术实现步骤摘要】
一种鸡肌内前体脂肪细胞的分离、培养及诱导分化方法
本专利技术涉及一种鸡肌内前体脂肪细胞的分离、培养及诱导分化方法，属于细胞学

技术介绍
家禽机体能量的主要来源是储存脂肪，但过多沉积皮下脂肪和腹脂会带来更多饲料转化率和肉品质等方面的影响。肉品质等方面的负面效应(肌内脂肪－IMF)是影响肉质性状的主要因素。肌内脂肪(Intramuscularfat)是指沉积于肌内膜或肌束膜内外的脂质，可以影响肌肉品质(嫩度、口感、风味)。在一定程度上，肌内脂肪的含量越高，肉的品质就越好；然而，鸡腹部脂肪蓄积过多会降低饲料的利用效率，也会额外增加加工费用，并造成一定的环境污染。开展优质鸡IMF沉积和肉品质性状等方面的研究，平衡肌内脂肪含量与腹脂沉积涉及的肉品质与生产效率的两个指标，为发掘优质地方鸡种IMF沉积的分子调控机制奠定理论基础。细胞体外分离培养是研究复杂生物系统的重要方法，通过分离培养鸡肌内前体脂肪细胞，在体外重现增殖分化过程，是研究家禽肌内脂肪沉积机理的重要途径。与一般家畜动物(猪、牛、羊)不同，禽类肌内脂肪在组织中分布不均匀且肉眼不可见，因此无法直接分离肌内脂肪组织；另外，由于从肌肉组织分离前体肌内脂肪细胞和肌卫星细胞的密度差异不大，只能获得细胞的混合物，所以一直以来无法有效分离高纯度的肌内前体脂肪细胞。因此，如何有效地将鸡肌内前体脂肪细胞分离、培养、诱导分化对深入研究家禽肉品质具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸡肌内前体脂肪细胞的分离、培养及诱导分化方法。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种鸡肌内前体脂肪细胞的分离、培养及诱导分化方法，包括如下步骤：1)取雏鸡的胸肌组织，剪碎后用I型和II型胶原酶混合酶液消化，得消化液；2)将步骤1)得到的消化液过滤后离心取下层沉淀细胞，接种于培养瓶内培养2h后，弃去培养基，贴壁的即为肌内前体脂肪细胞；3)用完全培养基培养肌内前体脂肪细胞后，用诱导培养基培养、再用维持培养基培养，然后用完全培养基培养至细胞出现脂滴，即可；所述诱导培养基为完全培养基中加入3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、罗格列酮和油酸；所述维持培养基为完全培养基中加入胰岛素、罗格列酮和油酸。在现有的哺乳动物领域，激素混合物被广泛用来诱导前脂肪细胞分化，其成分包括胰岛素(INS)，地塞米松(DEX)，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)，但激素混合物不能诱导禽类前脂肪细胞分化。人前脂肪细胞的诱导分化需要添加INS，DEX，IBMX，罗格列酮与甲状腺激素，而在羊和猪中，其前脂肪细胞的分化需要胰岛素，DEX，IBMX，罗格列酮的共同诱导。但是禽类脂肪从头合成的主要部位在肝脏，肝外脂肪组织自身合成脂肪的能力低下，因此在禽类前脂肪细胞的诱导仅仅依靠传统的INS，DEX和IBMX往往不够，需要额外添加一定量的外源脂肪酸才能正常分化。脂肪细胞增殖分化需要细胞外因子和细胞内因子的协同作用，在体外培养前脂肪细胞的培养基中，加入胎牛血清并添加胰岛素(INS)、地塞米松(DEX)和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)能诱导哺乳动物前脂肪细胞分化但不能诱导鸡前脂肪细胞分化，在培养物中加入油酸可诱导鸡前脂肪细胞分化。油酸是诱导因子也是甘油三酯合成原料，这是因为同哺乳动物相比，鸡脂肪组织本身不能合成脂肪酸，细胞内的脂肪酸基本都来源于血浆。罗格列酮是脂肪细胞分化关键转录因子PPARG的激活剂，他通过结合和活化PPARG，从而诱导前脂肪细胞分化，同时可增强细胞对胰岛素敏感性，促进脂肪细胞分化。本专利技术使用激素混合物使用激素混合物3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松和胰岛素，添加外源油酸及罗格列酮的诱导分化体系，该诱导体系中同时添加了外源油酸及罗格列酮，对于鸡肌内前体脂肪细胞油滴的发生具有更好的诱导效果，同时添加油酸和罗格列酮可在一定程度上形成协同作用，产生更大更多的脂滴。与仅单独加油酸及或罗格列酮的诱导体系相比，本申请的诱导体系可以在2至4天内可使90％以上的细胞产生明显的大脂滴(传统的诱导分化需要8-10天才能达到此效果)，更贴近鸡肌内脂肪细胞的诱导分化模型特点，具有诱导效率高、快捷的优点。本专利技术的方法能够为家禽肉品质，特别是禽类肌内脂肪沉积方向，提供一种有效的研究手段。步骤2)中采用差速贴壁法分离获得肌内前体脂肪细胞。肌内前体脂肪细胞贴壁要早于肌卫星细胞，因此在接种细胞1～3h后换液，即可除去未贴壁的肌卫星细胞。理论上前体肌内脂肪细胞和膜细胞在2h内完全贴壁，而肌卫星细胞贴壁时间大于2h。关于差速贴壁法换液时间的优化，分别采用换液时间为1h，1.5h和2h，结果发现2h时获得的细胞数量较多且活力较好。本专利技术步骤1)中选择14-21日龄雏鸡取胸肌细胞。在该阶段的雏鸡的胸肌肌内脂肪含量较高，且肌内前脂肪细胞分化能力强，生产油滴的能力强。优选的，步骤1)中混合酶液中I型和II型胶原酶的质量浓度分别为0.05％。消化的时间为60-120min。即100mL的DMEM/F12培养基添加50mgI型胶原酶和II型胶原酶及2g牛血清白蛋白(BSA)。步骤1)中消化时加入的混合酶液的量为鸡胸肌组织体积的5-10倍。本专利技术通过对不同胶原酶消化液(0.1％I型胶原酶消化液、0.1％II型胶原酶消化液、0.1％I型和II型胶原酶混合消化液)消化效果对比实验发现，采用等比例I型胶原酶和II型胶原酶混合消化液的效果最好；消化液的加入量优选为处理后的鸡胸肌组织体积的5-10倍，进一步优选为8倍。步骤1)中所述消化的温度为37℃，消化期间每隔5min摇动混匀一次，以消化液粘稠至絮状为佳。这样做的好处是避免因细胞消化过度而造成损伤，同时又可以保证获得更多的活细胞数量。本专利技术步骤2)中移除未消化的组织块后消化液依次经过200和500目的筛网。如采用一次过滤500目筛网则所需时间较长，使得细胞受外界污染概率增大。所以本专利技术第一步先通过去除肉眼可见的未消化完全的组织块，200目细胞筛去除较大的组织碎片，之后通过500目筛网，由于上皮细胞和其他杂细胞等体积较大不能通过，进而得到纯度较高的脂肪细胞。步骤2)中离心为于1000r/min离心5-10min。这样做的好处是可以减少对高速离心对原代细胞的损伤。步骤2)中接种细胞的浓度为0.5-1.5×106cells/cm2个。优选为1×106cells/cm2。在该浓度下既可以减少细胞材料的浪费，又能保证细胞有较快的增殖与分化速度，此外，该浓度下细胞生长状态较好，有利于脂肪细胞产生油滴。步骤1)中去除胸肌组织上肉眼可见的血管、筋膜和结缔组织后再进行剪碎。步骤1)中取胸肌组织之前，先用新洁尔灭给雏鸡整体消毒，再用75％的酒精浸泡消毒5分钟。本专利技术的诱导培养基为，在完全培养基中添加0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、1μM地塞米松(DEX)、10ug/mL胰岛素(INS)、1μM罗格列酮和250μM的油酸。研究表明，与哺乳动物脂肪细胞的诱导分化不同，单一的激素混合物(如鸡尾酒法：胰岛素，DEX，IBMX)不能够诱导禽类前脂肪细胞分化，外源添加脂肪酸类物质(如油酸)才能够诱导禽类前脂肪细胞分化，本专利技术的方法利用添加150、250、350μM不同浓度油酸对比实验发现，添加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡肌内前体脂肪细胞的分离、培养及诱导分化方法，其特征在于：包括如下步骤：1)取雏鸡的胸肌组织，剪碎后用I型和II型胶原酶混合酶液消化，得消化液；2)将步骤1)得到的消化液过滤后离心取下层沉淀细胞，接种于培养瓶内培养2h后，弃去培养基，贴壁的即为肌内前体脂肪细胞；3)用完全培养基培养肌内前体脂肪细胞后，用诱导培养基培养、再用维持培养基培养，然后用完全培养基培养至细胞出现脂滴，即可；所述诱导培养基为完全培养基中加入3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、罗格列酮和油酸；所述维持培养基为完全培养基中加入胰岛素、罗格列酮和油酸。

【技术特征摘要】
1.一种鸡肌内前体脂肪细胞的分离、培养及诱导分化方法，其特征在于：包括如下步骤：1)取雏鸡的胸肌组织，剪碎后用I型和II型胶原酶混合酶液消化，得消化液；2)将步骤1)得到的消化液过滤后离心取下层沉淀细胞，接种于培养瓶内培养2h后，弃去培养基，贴壁的即为肌内前体脂肪细胞；3)用完全培养基培养肌内前体脂肪细胞后，用诱导培养基培养、再用维持培养基培养，然后用完全培养基培养至细胞出现脂滴，即可；所述诱导培养基为完全培养基中加入3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、罗格列酮和油酸；所述维持培养基为完全培养基中加入胰岛素、罗格列酮和油酸。2.根据权利要求1所述的分离、培养及诱导分化方法，其特征在于：步骤1)中选择14-21日龄雏鸡取胸肌细胞。3.根据权利要求1所述的分离、培养及诱导分化方法，其特征在于：步骤1)中混合酶液中I型和II型胶原酶的质量浓度分别为0.05％。4.根据权利要求3所述的分离、培养及诱导分化方法，其特征在于：步骤1)中消化的温度为37℃，时间为60-120min。5.根据权利要求1所述的分离、...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙桂荣，张蒙，李东华，康相涛，李国喜，蒋瑞瑞，韩瑞丽，李转见，田亚东，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41