生物脱霉剂及制备方法技术

本发明专利技术公开一种生物脱霉剂，由益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体混合、干燥而成，所述益生菌在宿主消化道内定植时间至少12小时，益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体的质量比为1：5~25。制作方法依次按照如下步骤进行：取在宿主消化道内定植时间至少12小时的益生菌扩大培养，用PBS缓冲液制成菌悬液；按菌悬液与酵母细胞壁质量比2~10：1的比例向菌悬液中加入酵母细胞壁，测蛋白总量；再加入碳二亚胺，缓慢搅拌后避光反应8~24 h，蛋白总量与碳二亚胺的质量比为0.2~10：1；将反应液离心弃上清，向沉淀中加入生理盐水溶解沉淀；加入载体混合后干燥成粉，沉淀与载体的质量比为1：5~25。

Biological agent and preparation method

The invention discloses a biological mould inhibitor, which is mixed and dried by probiotics / yeast cell wall conjugate with the carrier. The probiotic colonization time is at least 12 hours in the host digestive tract, and the mass ratio of probiotics / yeast cell wall conjugate to carrier is 1:5~25. Preparation method comprises the following steps: enlarging planting time of at least 12 hours of probiotics in the host digestive tract cultured with PBS buffer into the bacterial suspension; according to the bacterial suspension and the yeast cell wall mass ratio of 2~10:1 to the bacterial suspension of yeast cell wall was added, measuring the amount of protein added carbon; two imine, after mixing light slow reaction of 8~24 h, the quality of the total protein and carbon two imines is 0.2~10:1; the reaction solution was centrifuged to precipitate the supernatant, adding saline dissolution precipitation; adding carrier mixed after drying into powder, the quality of precipitation and carrier ratio is 1:5~25.

【技术实现步骤摘要】
生物脱霉剂及制备方法
本专利技术属于饲料添加剂领域，尤其涉及一种价廉高效、可稳固吸附饲料中多种霉菌毒素的生物脱霉剂及制作方法。
技术介绍
霉菌毒素是由霉菌或其他真菌产生的广泛存在于农作物、食品及饲料中的一类有毒有害物质（DarwishWS，etaI．，2014）。对畜禽养殖业而言，它能够侵害动物肝脏肾脏，严重阻碍动物体正常新陈代谢及免疫机能，有的甚至能够致癌、致畸（AwadW,eta1．，2013）。在饲料原料收集、产品加工、保存运输以及销售使用过程中均不免受到霉菌及其毒素污染，可以说霉菌毒素无处不在（汤少伟等，20l0）。其中黄曲霉毒素对人类和动物健康的威胁己为人所熟知(GuntherA．，etal.)，另外有研究发现饲料（尤其含玉米饲料）中主要霉菌毒素为呕吐毒素、烟曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，而且多种毒素并存现象普遍(ChenandRawlings，2008)。尤其最近几年农作物副产物（如棉籽粕、菜籽粕、葵籽粕、麸皮等）被饲料大量使用，使得饲料中霉菌毒素含量成倍增长。目前，对于饲料中霉菌毒素的处理方法有以下几种，分别存在着不同问题。1.吸附处理大多是以活性炭和蒙脱石等铝硅酸盐为吸附剂，脱毒方法单一且非特异性，甚至能够吸附饲料中的维生素、微量元素等营养成分，难以降解而造成环境的蓄积性污染。另外还有以酵母细胞壁提取物（简称酵母细胞壁）为吸附剂，酵母细胞壁的特殊空间结构提供了更多的毒素结合位点，通过氢键和范德华力等分子间作用力可稳固吸附多种霉菌毒素，形成多糖-毒素复合物，阻止毒素被肠道吸收。具有特异性强、添加量少、在胃肠道内稳定性高及排出后可以被降解等特点，但在肠道停留时间短，吸附不完全。2.生物降解李俊霞等人（2008）筛选出一株能降解黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）B1的嗜麦芽窄食单胞菌，并对其在生物脱毒的应用领域进行了初步研究（2008）。但是该菌株只能降解黄曲霉毒素，而且价格较高，限制了其大规模应用推广。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术存在的上述技术问题，提供一种价廉高效、可稳固吸附饲料中多种霉菌毒素的生物脱霉剂及制作方法。本专利技术的技术解决方案是：一种生物脱霉剂，由益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体混合、干燥而成，所述益生菌在宿主消化道内定植时间至少12小时，所述益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体的质量比为1：5~25。上述生物脱霉剂的制作方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.取在宿主消化道内定植时间至少12小时的益生菌扩大培养，培养液经离心、弃上清液后取菌泥，用生理盐水洗涤菌泥后，再用pH8.0的PBS缓冲液制成菌悬液；b.按菌悬液与酵母细胞壁质量比2~10：1的比例向菌悬液中加入酵母细胞壁，测蛋白总量；再加入碳二亚胺，缓慢搅拌后避光反应8~24h，所述蛋白总量与碳二亚胺的质量比为0.2~10：1；c.将反应液离心弃上清液，向沉淀中加入2~10倍体积生理盐水溶解沉淀；d.加入载体混合后干燥成粉，所述沉淀与载体的质量比为1：5~25。本专利技术的生物脱霉剂可在宿主消化道短暂定植，不但可保护肠道粘膜还可使酵母细胞壁彻底（不留死角）吸附饲料中的各种霉菌及霉菌毒素；使用方法简易灵活，可以拌入饲料或放入饮水摄入；每吨饲料只需添加100g左右即可，用量少，价格低廉。附图说明图1是本专利技术实施例1枯草芽孢杆菌与酵母细胞壁偶联物镜检图。图2是本专利技术实施例1中FITC荧光染色的霉菌镜检图。图3是本专利技术实施例1实验动物粪便抹片在荧光显微镜下的镜检图。图4是本专利技术实施例1对照组和试验组处理后4h消化道粘膜镜检图。图5是本专利技术实施例1对照组和试验组处理后12h消化道粘膜镜检图。具体实施方式实施例1：本专利技术的生物脱霉剂是由枯草芽孢杆菌/酵母细胞壁偶联物与葡萄糖混合、干燥而成，所述枯草芽孢杆菌在宿主消化道内定植时间至少12小时，所述枯草芽孢杆菌/酵母细胞壁偶联物与葡糖糖的质量比为1：15。依次按照如下步骤制备：a.取在宿主消化道内定植时间至少12小时的枯草芽孢杆菌（保藏号:CICC20683）种子液以1：100（VN）比例接种于1000mL/5000mL装有培养基的三角烧瓶中，37℃震荡培养过夜，待菌株生长至对数后期离心收集菌体沉淀，然后用无菌PBS（pH8.0）洗涤2~3次，最后用适当体积PBS缓冲液（pH8.0）制成菌悬液备用；b.按菌悬液与酵母细胞壁质量比5：1的比例向菌悬液中加入酵母细胞壁（MOS），测蛋白总量；再加入碳二亚胺（EDC），缓慢搅拌后避光反应15h，所述蛋白总量与碳二亚胺的质量比为5：1；c.将反应液离心弃上清液取沉淀，即得到枯草芽孢杆菌与酵母细胞壁偶联产物，向沉淀中加入5倍体积生理盐水溶解沉淀；d.加入葡萄糖混合后干燥成粉，所述沉淀与葡萄糖的质量比为1：15。枯草芽孢杆菌（保藏号:CICC20683）定植时间是按照如下方法确定的：将购买的益生菌菌种分别接种在营养琼脂培养基上进行培养，从平皿上挑取各菌株单菌落，接种于50mL/250mL兰角锥瓶中，37℃震荡培养8~10h，待菌株生长至对数期时，4℃5000r/min离心沉淀菌体，并用无菌PBS（pH7.4）洗涤2~13次。最后重悬于PBS溶液（pH7.4）中，使菌液终含量达108CFU/mL。然后将其与FITC溶液按10：1（V/V）混合，4℃标记2h后再次使用无菌PBS（pH7.4）洗涤5次，菌体终含量仍保持108CFU/mL。将已经荧光标记的益生菌经口饲喂分别给10只健康鸡，剂量为lmL/只。经处理后第1、3、6、12……68h时，每个时间点随机选2只试验鸡进行剖检，分别取其食道、嗉囊、腺胃、肌胃、十二指肠、空回肠、盲肠、泄殖腔等部位粘膜以及粪便样品进行荧光示踪检测，确定益生菌在宿主消化道各部位中的定植部位定植时间。将实施例1所得偶联产物进行革兰氏染色镜检，结果如图1所示。从图1可以看出枯草芽孢杆菌与酵母细胞壁偶联成功。本专利技术实施例1生物脱霉剂的应用效果评价：具体实验步骤如下：①实验动物：彻底清扫鸡舍并进行常规消毒，即入雏前3天进行高锰酸钾．福尔马林熏蒸消毒24h（W:V=1:2），注意熏蒸时舍温控制在15℃以上。试验鸡采用网上平养，统一饲喂专用不含任何微生态制剂的饲料。正常饲养至1月龄备用，期间按常规程序进行免疫和消毒；②霉菌荧光标记：将采购的霉菌菌种（黄曲霉ATCC28539和禾谷镰刀菌ATCC200362）进行扩增培养。先取1mL种子液接种于1LYPD培养基中，30℃条件下培养48h；然后于6000r/min转速下离心10min收集菌体，弃上清液。然后使用PBS（pH7.4）洗涤3次后，重新悬浮并调使混合菌液终浓度达到108CFU/mL；然后与FITC溶液按10:1（V/V）混合，4℃标记2h后使用PBS（pH7.4）洗涤5次，重新悬浮使菌液浓度达到108CFU/mL，荧光标记的霉菌如图2所示。所述黄曲霉、禾谷镰刀菌均来源于美国ATCC菌种库。③将实验鸡随机分为2组，每组4只，雌雄各半。一组为对照组，饲喂荧光标记霉菌菌液，0.5h后饲喂按每吨饲料添加100g的传统脱霉剂（酵母细胞壁吸附剂），另一组为试验组，饲喂荧光标记霉菌菌液，0.5h后饲喂同等剂量的本专利技术实施例1生物脱霉剂。④每隔2h采集鸡粪，直至饲喂后24h。用PBS（pH7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物脱霉剂，其特征在于：由益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体混合、干燥而成，所述益生菌在宿主消化道内定植时间至少12小时，所述益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体的质量比为1：5~25。

【技术特征摘要】
1.一种生物脱霉剂，其特征在于：由益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体混合、干燥而成，所述益生菌在宿主消化道内定植时间至少12小时，所述益生菌/酵母细胞壁偶联物与载体的质量比为1：5~25。2.一种如权利要求1所述生物脱霉剂的制作方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.取在宿主消化道内定植时间至少12小时的益生菌扩大培养，培养液经离心、弃上清液后取菌泥，用生理盐水洗涤...

【专利技术属性】
技术研发人员：江国托，刘艳，林洋，王效禹，单春乔，王杲强，
申请(专利权)人：大连三仪动物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21