检测序列差异的方法技术

本发明专利技术涉及分析核酸样品中单核苷酸差异基因型的方法。更具体地说，本发明专利技术提供了鉴别基因组ＤＮＡ样品中多态性位点或多态性位点组处的核苷酸的方法。该方法使用标签引物延伸，其中一组标签序列对应于多态性位点处的核苷酸。引物延伸产物使用通用的一组标签特异性引物进行ＰＣＲ扩增，其中下游引物带有可区分标记物。根据大小和／或电荷分离后，在预期大小的产物中检测可区分标记物可以确定多态性位点处的核苷酸。该方法非常适于分析一系列反应物中多处单核苷酸差异的基因型。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鉴定个体基因组中相对于个体所在群体序列的序列差异的分子遗传学方法。更具体地说，本专利技术涉及鉴定基因组序列中单核苷酸差异的方法。
技术介绍
包含生物有机体基因组的核酸携带有该生物有机体的遗传信息。个体间基因序列的变异导致多种明显表型差异(如头发、皮肤等的颜色)和多种不明显差异(如药物耐受性和疾病敏感性)。即使核苷酸序列中细微的改变，包括单碱基对替换也对蛋白质的质量或数量有显著的影响。单核苷酸改变指单核苷酸多态性或简称SNP，发生SNP的位点在本文中称为多态性位点。DNA多态性定位于整个基因组中，定位在基因之中和基因之间，各种形式会导致或不导致不同的基因功能(通过比较同一序列的两种替代形式的功能而确定)。大多数多态性不改变基因功能，称为“中性”多态性。其他的多态性例如通过改变蛋白质的氨基酸序列，或改变诸如启动子或RNA剪切或降解信号的控制序列而改变基因功能，更通常地称为突变。与SNP相关的疾病包括.镰刀形红细胞贫血病、β-地中海贫血症、糖尿病、囊肿性纤维化、高脂蛋白血症、各种自身免疫性疾病和一些癌症的形成，例如由突变的p53所致的癌症。除了导致或影响疾病状态，点突变还改变对疾病的致病性或易感性，并导致对治疗的耐受性。检测DNA序列中特定核苷酸改变或突变的能力可用于许多医疗和非医疗目的。鉴定核苷酸改变的方法使得能够筛选并诊断和SNP相关的疾病。在鉴定疾病相关基因的遗传学研究中多态性也是有用的。如果一种多态性改变一个或多个基因的功能，使疾病易感性增加，则与未患病的个体相比，该多态性将更经常存在于患病的个体中。统计学方法可以用来评价患病群体相对于正常群体来说出现多态性的频率，并促进多态性和疾病表型之间因果关系的建立。能够快速鉴定与疾病相关的序列改变的方法在批准预防措施、评估发病可能性和评价疾病的诊断中是有价值的。例如，SNP的非医疗应用包括微生物或其具体菌株的检测，以及法医检定。SNP有用性的中心在于根据已知的SNP鉴定个体基因型的能力。已经采取了许多方法来解决该问题。例如，一些多态性意外地导致限制性内切酶切割位点的改变，从而对切割的基因组DNA样品进行电泳分离时可以发现片段模式改变。这是限制性片段长度多态性分析或RFLP分析的基础。RFLP分析的缺点是它只能检测影响限制性内切酶切割位点的改变，且该方法依赖于凝胶电泳和染色，该特点限制其检测量。还可以使用单链构象多态性(SSCP)分析来检测扩增DNA片段中的SNP。在该方法中，将扩增的片段变性，然后使之在电泳时的非变性聚丙烯酰胺凝胶中重新退火。单核苷酸序列变化的存在会导致相对于野生型序列的构象和电泳迁移率方面的可检测变化。该方法的缺点是依赖于聚丙烯酰胺凝胶电泳。基于杂交的方法采用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针(例如参见欧洲专利申请EP-237362和EP-329311)。例如，基于杂交的方法包括在探针RNA样品DNA双链体中的错配位点进行核糖核酸酶A切割，或对探针DNA样品DNA双链体中的错配位点进行变性梯度凝胶电泳(在Landegren et.，Science 242229-237，1988；Rossiter et al.，J.Biol.Chem.26512753-12756，1990中作有评论)。分析SNP基因型的其他方法采用等位基因特异性扩增(例如参见美国专利No.5,521,301；5,639,611和5,981,176)、微测序(mini-sequencing)方法、定量RT-PCT方法(例如所谓的“TaqMan分析”；例如参见授权给Gelfand的美国专利No.5,210,015；授权给Livak等人的美国专利No.5,538,848；和授权给Haaland的美国专利No.5,863,736；以及Heid，C.A.，et al.，Genome Research，6986-994(1996)；Gibson，U.E.M，et al.，Genome Research 6995-1001(1996)；Holland，P.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887276-7280，(1991)；和Livak，K.J.，et al.，PCR Methods andApplications 357-362(1995))和单核苷酸引物延伸(SnuPE)分析(例如美国专利No.5,846,710)及相关的延伸分析(例如美国专利No.6,004,744；5,888,819；5,856,092；5,710,028和6,013,431)。在本领域中需要有改进的SNP基因型分析方法。大多数SNP基因型分析方法都一定程度上依赖于PCR扩增，以产生用于分析的足够材料(如SSCP分析)，或使一种形式相对于另一种形式差异扩增，以检测差异(如引物延伸分析)。为了增加基于PCR方法的检测量，正致力于放大反应体系，以便在一次反应中可以检测到多种SNP。通过简单地加入对包含多种SNP的片段特异的引物对来放大面临一个问题，导致该问题的原因是引物的相互作用致使靶片段不足量扩增并产生假阳性片段。在本领域中需要有改进的放大SNP基因型分析方法。已经使用毛细电泳(CE)来验证SNP。一项研究使用了CE对单核苷酸聚合酶延伸分析的结果进行分析(Piggee et al.，1997，J.ChromatographyA.781367-375)。在该项研究中，PCR扩增的、含有已知SNP的DNA按照下述方法进行分析使引物紧靠多态性位点杂交，用单荧光标记的链终止子对引物进行延伸，然后对掺入的探针进行CE分离并检测。在另一项研究中，PCR扩增的、含有已知SNP的DNA用一种或两种相同荧光标记的链终止子进行延伸，然后进行掺入标记物的CE分离和检测。根据寡核苷酸的CE迁移率的序列特异性差异确定掺入的终止子。McClay等(2002，Anal.Biochem.301200-206)描述了一种SNP基因型分析方法，包括使用3’-端碱基不同、具有通用上游引物的一组两种不同荧光标记物的引物进行PCR，然后进行CE和荧光检测。通过将不同大小和电泳特征的扩增产物混合在一起而增加了检测量。美国专利No.6,074,831教导了根据图论技术同时将分子分离成亚组的CE的用途，和该方法在SNP基因型分析上的应用。美国专利No.6,322,980描述了在利用聚合酶的外切酶活性使荧光标记物从与多态性位点杂交的引物中释放的SNP检测方法中CE的用途。美国专利No.6,270,973也描述了在涉及核酸探针解聚活性的SNP基因型分析方法中CE的用途。美国专利No.6,312,893描述了产生带有有机标签的片段的测序方法，其中所述标签和特定的核苷酸相关。所述片段通过CE分离，然后从片段切除标签，通过非荧光分光光度法或电势测定法检测切下的标签。美国专利No.6,156,178描述了在利用解聚活性从与多态性位点杂交的引物中释放识别性核苷酸的SNP检测方法中CE的用途。上述方法都没有在引物延伸或扩增步骤中使用核酸序列标签，使用不同的引物进行延伸和扩增，使用通用扩增引物组或进行实时扩增监测和检测。
技术实现思路
本专利技术提供了用于分析核酸样品中序列差异基因型的方法。在优选的方面中，该方法可用于确定单核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别给定核酸样品中已知多态性位点处的核苷酸的方法，该方法包括：　　　　ａ）使从核酸样品产生的引物延伸产物群经历扩增过程，每个引物延伸产物包含一个标签序列，所述标签序列特异对应于已知多态性位点处一个特定核苷酸的存在，其中所述扩增过程使用一个上游扩增引物和一组可区分标记的下游扩增引物进行，所述下游扩增引物组的每个成员包含所述引物延伸产物群成员所带有的所述标签序列和可区分标记物，其中每种可区分标记物特异对应于所述多态性位点处特定核苷酸的存在；和　　　　ｂ）检测可区分标记物向核酸分子中的掺入，从而鉴别所述多态性位点处的核苷酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：弗拉基米尔I斯列普尼奥夫，
申请(专利权)人：桑蒂翁有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]