电化学可控细菌粘附界面的构建及使用方法技术

本发明专利技术提出了一种构建可逆切换的细菌吸附和释放界面的新方法。该方法是将锌的二吡啶胺配合物修饰到导电界面上构建细菌粘附界面，可以快速高效地吸附细菌，而通过电化学还原后可变为防污界面，释放细菌。防污界面加入Zn(NO3)2后又可恢复为细菌粘附界面，从而实现界面的可控调节。本细菌粘附界面构建简单，使用方便，并可重复利用。

Construction and use of adhesive interface for electrochemical controlled bacteria

A new method for constructing a reversible switched bacterial adsorption and release interface is proposed. The method is to modify the zinc pyridine amine complex on the conductive interface to construct the bacterial adhesion interface, which can adsorb bacteria quickly and efficiently, but after electrochemical reduction, it can become an anti fouling interface and release bacteria. Two When the antifouling interface is added to Zn (NO3) 2, it can be restored to the adhesion interface of the bacteria, thus the controllable adjustment of the interface is realized. The adhesion interface of the bacteria is simple, easy to use and can be reused.

【技术实现步骤摘要】
电化学可控细菌粘附界面的构建及使用方法
本专利技术涉及纳米生物医学领域，具体为一种电化学可控细菌粘附界面的构建及使用方法。
技术介绍
细菌是全世界饮用水中的主要污染物，特别是在发展中国家。细菌污染可能导致严重的健康问题，包括食物中毒和疾病。根据国际水组织调查研究表明，世界上每十个人中就有一个无法获得安全的水，每年有一百多万人死于与水有关的疾病。此外，生物污染近年来一直作为重大经济和生态问题而受到极大关注。表面微生物和宏观生物的聚集可能会产生严重的后果，包括但不限于医疗手术操作失败、增加船舶燃料消耗、加速水下传感器的老化过程等。根据国际海事组织（IMO）的最新统计报告，无防污保护的海上运输年度成本比有效防污保护的海运要高约1500亿美元。开发可用于收集污染物（例如生物大分子或细菌）然后用外部信号刺激释放污染物以便分析其组成的材料是非常有意义的。目前，用于收集、检测、分析和清洁细菌污染的材料或表面涂层的研究正在日益增加。
技术实现思路
本专利技术针对以上不足之处，提供了一种构建可逆切换的细菌吸附和释放界面的新方法。该方法是将锌的二吡啶胺配合物修饰到导电界面上构建细菌粘附界面，可以快速高效地吸附细菌，而通过电化学还原后可变为防污界面，释放细菌；防污界面加入Zn(NO3)2后又可恢复为细菌粘附界面，从而实现界面的可控调节；本细菌粘附界面构建简单，使用方便，并可重复利用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种电化学可控细菌粘附界面的构建方法，包含有如下步骤：（1）二吡啶胺的制备；将400-600mg多聚甲醛和2.8g二甲基吡啶胺置于250mL的圆底烧瓶中，加入15mL乙醇和45mL水；然后加入1.0g对羟基苯丙酸甲酯和1.4mL1.0M盐酸，回流24h；将反应混合物冷至室温，用饱和Na2CO3中和至中性，然后用过量的氯仿萃取溶液，有机相用Na2SO4干燥，减压蒸发氯仿；粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得到浅黄色油状物即为二吡啶胺。（2）细菌粘附界面的构建；将导电玻璃ITO先在丙酮、异丙醇及去离子水中各超声5min，在真空中干燥；将干燥后的ITO置于30mL1MHCL和30%H2O2的混合溶液中，二者体积比为1:1，浸泡30min，用水洗涤。然后转入1MNaOH的乙醇溶液中，此溶液中乙醇与水的体积比为1:1，超声10min，用水洗涤；然后加入5%APTES水溶液，浸泡1h进行氨基化，水洗3次，80℃干燥过夜；取50mg步骤一中制备的二吡啶胺，加入250mgEDC和500mgNHS，反应2h，调溶液pH至8.0，加入到氨基化的ITO中浸泡过夜，二次水洗涤，真空干燥；最后，加入2-5μMZn(NO3)2，搅拌30min，细菌粘附界面构建完成。电化学可控细菌粘附界面的使用方法，包含有如下步骤：（1）细菌的吸附和解离将培养细菌的LB溶液置于8000rpm下离心5min，从中分离出细菌，将分离出的细菌用无菌中性PBS缓冲液，洗涤3次并悬浮在PBS缓冲液中，控制细菌在600nm处的吸光度为0.6；将完成细菌粘附界面构建的ITO加入到500μL细菌溶液中，在室温下在恒温摇床上进行吸附过程，并持续监测上清液中600nm处的吸光度；通过在显微镜下操作的细胞计数板将600nm处的吸光度转换为细菌浓度来计算最大细菌吸附数；将细菌吸附的ITO置于电解槽的阴极处作为工作电极，Pt线作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极；通过施加-1.0V的电压15分钟还原锌离子，从而实现吸附细菌的解离；将吸附和解离细菌的ITO从溶液中取出，无菌PBS冲洗3次，然后用钙黄绿素在黑暗中孵育15分钟；使用装有金属卤化物灯的OlympusBX51显微镜，每个面积单位的细菌细胞用475nm的激发滤光片和535nm的滤光片进行检测；（2）吸附和解离细菌的可逆性上一步中解离细菌后ITO用PBS洗涤3次，然后加入2-5μMZn(NO3)2，搅拌30min，使界面恢复至细菌吸附界面，重新吸附细菌。本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术为可控细菌粘附界面的构建，应用范围广，可应用于各种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；（2）所用结合配体Zn-DPA对细菌选择性高，正常哺乳动物细胞的干扰小；锌的二吡啶胺配合物Zn-DPA可用于高选择性和快速结合细菌，成像体内细菌。使用这些配体的一个主要动机是Zn-DPA与高密度存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞的外膜上阴离子磷脂形成具有高选择性和快速结合动力学的配体键。Zn-DPA配位物对正常的哺乳动物细胞（包括白细胞）和带负电荷的蛋白质（如白蛋白）具有可忽略的亲和力。（3）与基于抗体的细菌捕获方法相比，Zn-DPA与细菌的结合具有更快的动力学，可以缩短孵育时间，有利于临床应用，且抗体是昂贵的并且具有潜在的免疫原性；（4）可以实现细菌粘附界面与防污界面的可逆调节，并可多次反复使用。附图说明图1是电化学调控细菌粘附和解离示意图；图2是化合物二吡啶胺在DMSO中的1HNMR波谱；图3是表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌四种细菌的Zeta电势值；图4是荧光成像（A:吸附，B：防污）和细胞计数（C）吸附和防污界面；图5是表皮葡萄球菌在不同循环中在Zn-DPA修饰ITO表面的吸附率。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细描述：如图所示为本专利技术的一个具体实施例，实施例1一种电化学可控细菌粘附界面的构建方法，包含有如下步骤：1）二吡啶胺的制备：将550mg多聚甲醛和2.8g二甲基吡啶胺置于250mL圆底烧瓶中，加入15mL乙醇和45mL水，然后加入1.0g对羟基苯丙酸甲酯和1.4mL1.0M盐酸，回流24h。反应混合物冷至室温，用饱和Na2CO3中和至中性，然后用过量的氯仿萃取溶液。有机相用Na2SO4干燥，减压蒸发氯仿。粗产物通过硅胶柱色谱纯化（甲醇:氯仿=5:95，v:v），得到浅黄色油状物即为二吡啶胺。其结构可由图2所示1HNMR波谱确定。（2）细菌粘附界面的构建：导电玻璃（ITO）先在丙酮、异丙醇及去离子水中各超声5min，然后在真空中干燥。干燥后的ITO置于30mL1MHCL和30%H2O2的混合溶液中（1:1，v:v），浸泡30min，浸泡完后用水洗涤。然后转入1MNaOH的乙醇溶液中（乙醇:水=1:1，v:v），超声10min，超声完后用水洗涤。然后加入5%APTES（(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷）水溶液，浸泡1h进行氨基化，水洗3次，80℃干燥过夜。取50mg步骤一中制备的二吡啶胺，加入250mgEDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和500mgNHS（N-羟基琥珀酰亚胺），反应2h，调溶液pH至8.0，加入到氨基化的ITO中浸泡过夜，二次水洗涤，真空干燥。最后，加入3μMZn(NO3)2，搅拌30min，细菌粘附界面构建完成。电化学可控细菌粘附界面的工作原理如图1所示，使用方法包含有如下步骤：(1)细菌的吸附和解离。将培养细菌的LB溶液置于8000rpm下离心5min，从中分离出细菌，将分离出的细菌用无菌中性PBS缓冲液洗涤3次并悬浮在PBS缓冲液中。控制细菌在600nm处的吸光度为0.6。将修饰好的ITO加入到细菌溶液（500μL）中，在室温下在恒温摇床上进行吸附过程，并持续监测上清液中600nm处本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种电化学可控细菌粘附界面的构建方法，其特征在于，包含有如下步骤：（1）二吡啶胺的制备；将400‑600mg多聚甲醛和2.8 g二甲基吡啶胺置于250 mL的圆底烧瓶中，加入15 mL乙醇和45 mL水；然后加入1.0 g对羟基苯丙酸甲酯和1.4 mL 1.0 M盐酸，回流24 h；将反应混合物冷至室温，用饱和Na2CO3中和至中性，然后用过量的氯仿萃取溶液，有机相用Na2SO4干燥，减压蒸发氯仿；粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得到浅黄色油状物即为二吡啶胺；（2）细菌粘附界面的构建；将导电玻璃ITO先在丙酮、异丙醇及去离子水中各超声5 min，在真空中干燥；将干燥后的ITO置于30 mL 1M HCL和 30% H2O2的混合溶液中，二者体积比为1:1，浸泡30 min，用水洗涤；然后转入1 M NaOH的乙醇溶液中，此溶液中乙醇与水的体积比为1:1，超声10 min，用水洗涤；然后加入5% APTES水溶液，浸泡1 h进行氨基化，水洗3次，80℃干燥过夜；取50 mg步骤一中制备的二吡啶胺，加入250 mg EDC和500 mg NHS，反应2 h，调溶液pH至8.0，加入到氨基化的ITO中浸泡过夜，二次水洗涤，真空干燥；最后，加入2‑5μM Zn(NO3)2，搅拌30 min，细菌粘附界面构建完成。...

【技术特征摘要】
1.一种电化学可控细菌粘附界面的构建方法，其特征在于，包含有如下步骤：（1）二吡啶胺的制备；将400-600mg多聚甲醛和2.8g二甲基吡啶胺置于250mL的圆底烧瓶中，加入15mL乙醇和45mL水；然后加入1.0g对羟基苯丙酸甲酯和1.4mL1.0M盐酸，回流24h；将反应混合物冷至室温，用饱和Na2CO3中和至中性，然后用过量的氯仿萃取溶液，有机相用Na2SO4干燥，减压蒸发氯仿；粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得到浅黄色油状物即为二吡啶胺；（2）细菌粘附界面的构建；将导电玻璃ITO先在丙酮、异丙醇及去离子水中各超声5min，在真空中干燥；将干燥后的ITO置于30mL1MHCL和30%H2O2的混合溶液中，二者体积比为1:1，浸泡30min，用水洗涤；然后转入1MNaOH的乙醇溶液中，此溶液中乙醇与水的体积比为1:1，超声10min，用水洗涤；然后加入5%APTES水溶液，浸泡1h进行氨基化，水洗3次，80℃干燥过夜；取50mg步骤一中制备的二吡啶胺，加入250mgEDC和500mgNHS，反应2h，调溶液pH至8.0，加入到氨基化的ITO中浸泡过夜，二次水洗涤，真空干燥；最后，加入2-5μMZn(NO3)2，搅拌30min，细菌粘附界面构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：冀海伟，王仁亮，翟静，冯蕾，
申请(专利权)人：泰山医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37