基于纳米抗体检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了基于纳米抗体检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内的酶标板以及试剂；其中，酶标板的每个孔包被有三唑磷包被抗原，所述试剂包括抗三唑磷纳米抗体、三唑磷标准溶液、酶标记的二抗、缓冲液PBS、洗涤液PBST、底物液、显色液和反应终止液等。检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原和待测三唑磷相互竞争与抗体反应，通过显色反应观察结果。检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原和待测三唑磷相互竞争与抗体反应，通过显色反应观察结果。本发明专利技术的优点是能准确灵敏地检测水、蔬菜中三唑磷残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。

ELISA kit and its application on the detection of three azophos residue based on nano antibody

The invention discloses a nano ELISA kit for antibody detection of three Triazophos residue and its application based on the reagent box comprises a box body, a box body and a microtiter plate ELISA reagent; wherein each hole plate is coated with three Triazophos coated antigen, the reagent including resistance to Triazophos three nm antibody, three Triazophos standard solution, enzyme labeled two antibody, buffer PBS, washing liquid, PBST substrate solution, color liquid and reaction termination liquid etc.. During the testing process, the antigen and three azophos, which were adsorbed on the wall of the enzyme on the wall of the enzyme, were competing with the antibody against each other, and the results were observed by color reaction. During the testing process, the antigen and three azophos, which were adsorbed on the wall of the enzyme on the wall of the enzyme, were competing with the antibody against each other, and the results were observed by color reaction. The advantages of the invention are that it can detect the residue of three azophos in water and vegetables accurately and sensitively. The sample pretreatment process is simple and time consuming, and it can detect a large number of samples at the same time. The cost of sample detection is much lower than that of traditional instrument detection methods.

【技术实现步骤摘要】
基于纳米抗体检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用
本专利技术涉及基因工程、噬菌体展示技术以及ELISA检测
，具体地说，涉及基于纳米抗体检测三唑磷残留的ELISA试剂盒及其应用。
技术介绍
三唑磷(Triazophos)是一种应用较为广泛的有机磷酸酯类杀虫剂，对危害粮、棉、油、果蔬、茶叶等主要农作物的害虫都有良好的防治效果。三唑磷对鱼类、蜜蜂、家蚕毒性较大，对哺乳动物的毒性中等，其进入人体后会造成大量乙酰胆碱蓄积在神经效应器接点处，发生毒蕈碱样、烟碱样及中枢神经系统症状。在甲胺磷、对硫磷等高毒有机磷杀虫剂被限制或禁止使用之后，三唑磷的使用量近年来迅速增加，由于半衰期较长、易残留，环境和食品中残留超标问题逐渐引起关注。因此，加强三唑磷残留的检测，对于科学合理地使用三唑磷，保障食品安全和人类健康，减少环境污染，增强我国农副产品的国际竞争力，保持我国农业的可持续发展等具有重要意义。目前已报道的三唑磷残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和色谱-质谱联用(GC/LC-MS)。运用这些方法需要专业化的实验室、专用仪器设备及专业操作人员，样品前处理复杂，分析成本高，难以满足大量样本现场快速监测的需要。20世纪90年代以来，快速发展的免疫分析技术已被应用于农药残留分析和环境监测，具有简便快速、廉价高效、特异性强、灵敏度高等优点。基于常规抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)的三唑磷残留酶联免疫吸附分析方法稳定性相对较低，本专利技术以抗三唑磷纳米抗体为基础，采用酶联免疫吸附分析方法，其热稳定性均优于多克隆抗体免疫分析方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前农药残留仪器分析方法成本高、前处理复杂、特异性差、灵敏度低和难以实验现场检测等不足，提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的，分析三唑磷残留的ELISA检测试剂盒。适用于水、蔬菜等样品中三唑磷残留的快速测定。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一条用于构建驼科动物噬菌体展示纳米抗体文库的C端通用PCR引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。继而本专利技术提供提供一种抗三唑磷纳米抗体，所述抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将SEQIDNO:1所示序列去掉末端6个组氨酸标签后的氨基酸序列。所述抗三唑磷纳米抗体可以按如下方法进行制备：利用化学反应合成三唑磷的半抗原O-乙基-O-3-(1-苯基-1,2,4-三唑基)-N-(3-羧甲基)硫代磷酰胺酯，将半抗原与钥孔血蓝蛋白KLH偶联后作为免疫原，免疫实验动物骆驼，提取外周血淋巴细胞的总RNA，经反转录及巢式PCR，克隆出纳米抗体重链(VHH)基因片段，通过酶切连接，将基因片段克隆至噬菌粒载体，高效电转化至大肠杆菌，经辅助噬菌体拯救，构建得到噬菌体纳米抗体库，筛选出特异的三唑磷噬菌体纳米抗体，将其表达纯化，得到灵敏度高、特异性强的抗三唑磷纳米抗体。制备的纳米抗体分子小，可溶性强，耐高温，易纯化，易表达。本专利技术提供的分析三唑磷残留的ELISA检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及设在盒体内的试剂。其中，所述酶标板的每个孔包被有三唑磷包被抗原，所述试剂包括所述抗三唑磷纳米抗体、三唑磷标准溶液、酶标记的二抗、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液(A液)、显色液(B液)和反应终止液等。所述三唑磷包被抗原为半抗原O-乙基-O-3-(1-苯基-1,2,4-三唑基)-N-(3-羧甲基)硫代磷酰胺酯与牛血清蛋白的偶联复合物，所述包被抗原的制备方法如下：(1)称7.4mg(0.02mmol)O-乙基-O-3-(1-苯基-1,2,4-三唑基)-N-(3-羧甲基)硫代磷酰胺酯(MW＝370)、2.65mg(0.024mmol)NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，MW＝115)、4.8mg(0.023mmol)DCC(二环己基碳二亚胺，MW＝206)溶于200μL无水DMF(N-甲酰吗啉)中，室温下搅拌反应过夜。将反应液离心(5000rpm，10min)，弃沉淀，上清液为活性酯。(2)称20mgBSA(牛血清蛋白，MW＝67000)溶于2mL碳酸盐缓冲溶液(0.05mol/mL、pH9.5)中，搅拌下逐滴加入150μL活性酯液，滴加时缓慢，20～30min(优选20min左右)加完。然后室温下继续搅拌反应4～6h(优选4h左右)。(3)反应液装入透析袋内，用PBS(0.01mol/LpH7.4)透析。每6～8h(优选6h左右)换液一次，共换液5～6次。透析后离心，弃沉淀，取上清液，作为抗原包被液。所述酶标板为96孔酶标板，包被抗原的包被浓度为250ng/mL。所述纳米抗体的浓度大约为126ng/mL。所述酶标记的二抗为辣根过氧化物酶标记的抗HA标签抗体，浓度为0.1μg/mL。购自Abcam公司，商品编号:ab1265。所述显色液A液由过氧化脲1g、柠檬酸10.3g、Na2HPO4·12H2O35.8g、吐温-20100μL和蒸馏水1000mL配制而成，pH值5。所述显色液B液由四甲基联苯胺700mg、DMSO40mL、柠檬酸10.3g和蒸馏水1000mL配制而成，pH值2.4。所述反应终止液为2M的硫酸液。本专利技术还提供一种三唑磷ELISA检测试剂，其有效成分为所述抗三唑磷纳米抗体。本专利技术进一步提供所述试剂盒或试剂在ELISA法检测样品中三唑磷残留的应用。分析检测时，向包被有所述三唑磷包被抗原的酶标板的各孔中依次加入待测三唑磷样品和所述抗三唑磷纳米抗体，固相包被抗原和待测三唑磷相互竞争与纳米抗体反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的纳米抗体含量均一致，因此当待测的三唑磷浓度高时，则被结合在固相抗原上的抗体少，加入的酶标二抗与被固定抗体结合量少，最后加入底物液和显色液，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测三唑磷浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。根据用已知浓度的三唑磷标准溶液检测所绘制标准曲线，即可推算出待测三唑磷的浓度。本专利技术能准确灵敏地检测水和蔬菜中三唑磷残留，样品的前处理过程简单。对于水样，只需将其过滤后进行检测；对于蔬菜样品的前处理，参见“三唑磷残留检测直接竞争ELISA试剂盒的研制及应用，梁赤周等，中国食品学报，第8卷第6期，2008年12月”。本方法耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。本专利技术对解决大批量样品的三唑磷残留检测，实现现场监控具有重要的现实意义。附图说明图1为本专利技术实施例5中基于纳米抗体的三唑磷的标准抑制曲线。曲线回归方程为y＝1.0013+1.0757/[1+(x/8.4244)^0.0047](R2＝0.9994)抑制中浓度IC50＝8.6ng/mL，最低检测限IC10＝1.15ng/mL。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗三唑磷纳米抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.抗三唑磷纳米抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.分析三唑磷残留的ELISA检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及设在盒体内的试剂，其特征在于，所述酶标板的每个孔包被有三唑磷包被抗原，所述试剂包括权利要求1所述纳米抗体、三唑磷标准溶液、酶标记的二抗、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述三唑磷包被抗原为半抗原O-乙基-O-3-(1-苯基-1,2,4-三唑基)-N-(3-羧甲基)硫代磷酰胺酯与牛血清蛋白的偶联复合物，所述包被抗原的制备方法如下：(1)称7.4mgO-乙基-O-3-(1-苯基-1,2,4-三唑基)-N-(3-羧甲基)硫代磷酰胺酯、2.65mgNHS、4.8mgDCC溶于200μL无水DMF中，室温下搅拌反应过夜；将反应液离心，弃沉淀，上清液为活性酯；(2)称20mgBSA溶于0.05mol/mLpH9.5的碳酸盐缓冲溶液2mL中，搅拌下逐滴加入150μL上述活性酯，20～30min加完；然后室温下继续搅拌反应4～6h；...

【专利技术属性】
技术研发人员：许艇，王楷，刘志平，林优优，李季，布鲁斯·杜普里·哈莫克，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11