一种液质联用分析内毒素类脂A的方法技术

本发明专利技术公开了一种液质联用分析内毒素类脂A的方法，包括如下步骤：S1.菌株处理；S2.萃取内毒素类脂A：将冷冻干燥后的细胞进行水解反应，待冷却后将混合物离心，在清洗后的沉淀物中加入体积比为4:4:1的氯仿、甲醇、醋酸铵混合溶液，离心，收集上清液，用氮气吹干；S3.HPLC‑MS分析：通过增强子离子扫描模式获得碎片离子光谱以确定类脂A的结构信息。本发明专利技术建立了一种HPLC‑MS分析内毒素类脂A的方法，通过在线分离以及鉴定来确定类脂A的结构信息；采用1%醋酸进行水解，水解程度彻底；并且，通过加入1M浓度的醋酸铵提高类脂A的萃取效果。本发明专利技术方法可以检测出MALDI‑TOF未能检测出的分子量为2002.2和2126.4的类脂A的结构，可以广泛适用于不同的革兰氏阴性菌的类脂A分析。

A method for the analysis of lipopolysaccharide A by liquid chromatography

\u672c\u53d1\u660e\u516c\u5f00\u4e86\u4e00\u79cd\u6db2\u8d28\u8054\u7528\u5206\u6790\u5185\u6bd2\u7d20\u7c7b\u8102A\u7684\u65b9\u6cd5\uff0c\u5305\u62ec\u5982\u4e0b\u6b65\u9aa4\uff1aS1.\u83cc\u682a\u5904\u7406\uff1bS2.\u8403\u53d6\u5185\u6bd2\u7d20\u7c7b\u8102A\uff1a\u5c06\u51b7\u51bb\u5e72\u71e5\u540e\u7684\u7ec6\u80de\u8fdb\u884c\u6c34\u89e3\u53cd\u5e94\uff0c\u5f85\u51b7\u5374\u540e\u5c06\u6df7\u5408\u7269\u79bb\u5fc3\uff0c\u5728\u6e05\u6d17\u540e\u7684\u6c89\u6dc0\u7269\u4e2d\u52a0\u5165\u4f53\u79ef\u6bd4\u4e3a4:4:1\u7684\u6c2f\u4eff\u3001\u7532\u9187\u3001\u918b\u9178\u94f5\u6df7\u5408\u6eb6\u6db2\uff0c\u79bb\u5fc3\uff0c\u6536\u96c6\u4e0a\u6e05\u6db2\uff0c\u7528\u6c2e\u6c14\u5439\u5e72\uff1bS3.HPLC\u2011MS\u5206\u6790\uff1a\u901a\u8fc7\u589e\u5f3a\u5b50\u79bb\u5b50\u626b\u63cf\u6a21\u5f0f\u83b7\u5f97\u788e\u7247\u79bb\u5b50\u5149\u8c31\u4ee5\u786e\u5b9a\u7c7b\u8102A\u7684\u7ed3\u6784\u4fe1\u606f\u3002 The invention provides a HPLC MS analysis method to determine the lipid A endotoxin, lipid A structure information through online separation and identification; using 1% acetic acid hydrolysis, hydrolysis degree and thoroughly; improve the extraction effect of lipid A by adding ammonium acetate concentration of 1M. The method of the invention can detect the molecular detection of MALDI TOF failed to the amount of lipid A 2002.2 and 2126.4, lipid A can be widely applied to gram negative bacteria of different.

【技术实现步骤摘要】
一种液质联用分析内毒素类脂A的方法
本专利技术属于分析化学质谱鉴定
，更具体地涉及一种高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）分析内毒素类脂A的方法。
技术介绍
空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni，C.jejuni）是一种全球范围内人兽共患性、感染性腹泻的主要病原菌，是一种典型的革兰氏阴性菌，其感染率在世界各地普遍呈上升的趋势，世界卫生组织（WHO）早在1980年就将空肠弯曲菌引发的病例列为常见的食源性疾病。在欧美等发达国家如美国和新西兰，由C.jejuni引发的食源性细菌感染在一定程度上已经超过了沙门氏菌和志贺氏菌。家禽类动物是C.jejuni的主要寄主，未经加工的奶制品和未处理的水源也是该菌的主要载体。急性肠胃炎是C.jejuni感染的典型症状，免疫力低下者会进一步诱发心内膜炎、关节炎、骨髓炎、脑炎等全身性并发症，最严重的并发症是某些血清型C.jejuni感染引起周围神经系统自身免疫性疾病-格林巴利综合征（Guillain-BarreSyndrome,GBS），又称感染性脱髓鞘性多发性神经病。细胞膜脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）包含亲水性碳水化合物和疏水性的内毒素，空肠弯曲菌的LPS因为O-抗原的缺失而被称为脂寡糖（Lipooligosaccharide,LOS）。LOS是C.jejuni细胞膜的主要组成部分，它包含疏水性部分的内毒素类脂A和亲水性部分的低聚糖。由于其独特的类似人类神经节苷脂结构和潜在的参与诱导自身免疫性神经疾病如格林巴利综合征（GBS）和米勒费希尔综合征（MFS），C.jejuni的LOS结构描述备受研究者的关注。C.jejuni的细胞表面呈现多种结构，包括一些在空肠弯曲菌生物学中起重要作用的多糖，特别是和宿主细菌的相互作用。荚膜，一种高度变异的多糖，在细菌毒性、粘附和入侵上皮细胞中起到重要作用。LOS也是高度变异的，同样影响细菌在上皮细胞上的粘附和入侵，同时它还在血清抗性中起到重要作用。C.jejuni的LOS结构可以显示二乙基溴乙酰胺神经节糖苷的分子拟态，这和GBS和MFS是密切相关的。鞭毛在C.jejuni定殖、细胞毒性和上皮细胞的侵入中是必须的，并且可以分泌侵袭抗原。鞭毛蛋白被O-连接的糖基化修饰，这种修饰作用是鞭毛组件必须的，在其活力、毒性、上皮细胞的粘附和入侵中非常重要。而N-连接的糖基化则修饰细胞质和外膜蛋白，N-连接的糖基化作用同样在细菌定殖、上皮细胞粘附和入侵中非常重要，但是这些聚糖在以上过程中的具体作用尚不明确。大多数的革兰氏阴性菌自身修饰LPS或者LOS的疏水性部件类脂A，为了更好的防御阳离子抗微生物肽（CAMPs）和避免被宿主的Toll样受体（TLR4）或先天性免疫受体MD2检测到。C.jejuni的LOS中类脂A的化学结构已经得到阐明，它的特殊性在于类脂A分子的2’和3’位点上有二次长酰基链，并且在双糖骨架的1’和6’位点的磷酸盐基团上有磷酸乙醇胺（pEtN）的加入。图1对比了E.coli和C.jejuni类脂A的化学结构，虚键表示类脂A的自身改性。在图1（A）野生型E.coli中，附加磷酸基团连接在1’位点。图1（B）在激活转录调节因子PhoP和PmrA的条件下，E.coli的类脂A可以进一步衍生pEtN、4-氨基-4-脱氧左旋木糖、棕榈酸酯。在图1（C）的C.jejuni中，葡萄糖胺双糖骨架包含一个在O-4’上被取代为β-D-GlcN3N-(1→6)-α-D-GlcN(2,3-二氨基-2,3-双脱氧-D-葡萄糖)单元的磷酸单酯基团，最终形成另外两个酰胺连接的酰基链。典型的，类脂A是初期的3-羟基肉豆蔻酸14:0（3-OH）分别在N-2,N-2’andN-3’,和O-3位点通过酰胺基和酯链的酰化作用产生的。也有少数菌株的双糖主链并没有发现β-D-GlcN3N-(1→6)-α-D-GlcN3N或β-D-GlcN-(1→6)-α-D-GlcN。质谱（MS）已被广泛用于类脂A的鉴定，包括基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离子化质谱（ESI-MS）。由于MALDI扫描时间快、操作简单，所以是典型的用于分析类脂A的首选方法，尽管它不具备对高度复杂混合物同时进行定性和定量分析的能力。然而，不同的基质系统会导致检测到磷酸化程度的不同。另一方面，高效液相色谱质谱联用技术（HPLC-MS）对微量化合物的分析更有潜力，因为其中的信号在其他质谱方法检测过程中被削弱。HPLC-MS以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来。为保证内毒素类脂A的萃取效率和检测分析的准确性，亟需提供一种新的分析方法，用于类脂A的结构分析。
技术实现思路
针对上述现有技术中的问题，本专利技术的目的是在于提供了一种液质联用(HPLC-MS)分析内毒素类脂A的方法，方法易行，操作简便，帮助确定类脂A的结构信息。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。一种液质联用（HPLC-MS）分析内毒素类脂A的方法，包括如下步骤：S1.菌株处理（空肠弯曲菌C.jejuni菌株）：将干燥的细菌细胞均匀悬浮在水溶液中，控制细胞浓度1mg/mL，细胞定量后低压（10-13pa）冷冻（-40℃～-50℃）干燥处理；S2.萃取内毒素类脂A：将冷冻干燥后的细胞进行水解反应，待冷却（0-25℃）后将混合物离心，在清洗后的沉淀物中加入体积比为4:4:1的氯仿、甲醇、醋酸铵混合溶液，离心，收集上清液，用氮气吹干；S3.液质联用（HPLC-MS）分析：色谱条件：酰胺柱内径0.3mm，长度10cm；流动相A：10mM醋酸铵的水溶液；流动相B：含有10mM醋酸铵的96%（体积比，以下相同）四氢呋喃溶液；流速：50μL/min；洗脱梯度：98%（体积比，以下相同）B溶液3－5min，随后18－22min逐渐降至70%（体积比，以下相同）B溶液，维持70%B溶液9－11min，最后增加到98%B溶液；质谱条件：前体离子扫描模式中，选择负离子扫描模式时，碰撞能量从-30到-45eV；选择正离子扫描模式时，碰撞能量从+30到+50eV；通过增强子离子扫描模式获得碎片离子光谱以确定类脂A的结构信息。在现有技术中大多是用MALDI-TOF这种常用质谱方法分析类脂A，本专利技术采用了HPLC-MS对类脂A同时进行在线分离以及鉴定，该方法弥补了MALDI-TOF-MS过程中混合物中的物质电离相互抑制，含量低且电离能力差的物质电离被抑制而不能被检测到等缺点。使用氯仿-甲醇-醋酸铵的混合体系快速简单的从细胞中提取类脂A，醋酸铵的加入提高检测限；利用HPLC-MS可对不同细菌内的类脂A结构进行分析，在充分了解类脂A分子结构的基础上，进而可以通过分子生物学的手段来改造类脂A，为消灭病菌和开发疫苗提供理论基础。优选地，步骤S1所述细菌细胞为革兰氏阴性菌。空肠弯曲菌是革兰氏阴性菌的一种，其细胞膜脂多糖因为O-抗原的缺失而被称为脂寡糖，其中的疏本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种液质联用分析内毒素类脂A的方法，它包括下列步骤：S1. 菌株处理：将干燥的细菌细胞均匀悬浮在水溶液中，控制细胞浓度1mg/mL，细胞定量后低压10‑13pa冷冻‑40℃～‑50℃干燥处理；S2. 萃取内毒素类脂A：将冷冻干燥后的细胞进行水解反应，待冷却0‑25℃后将混合物离心，在清洗后的沉淀物中加入体积比为4:4:1的氯仿、甲醇、醋酸铵混合溶液，离心，收集上清液，用氮气吹干；S3.液质联用分析：色谱条件：酰胺柱 内径0.3mm，长度10cm；流动相A：10 mM 醋酸铵的水溶液；流动相B：含有 10 mM 醋酸铵的 96%体积比四氢呋喃溶液；流速：50 μL/min；洗脱梯度：98%体积比B溶液3－5min，随后 18－22min逐渐降至70%体积比B溶液，维持70% B溶液9－11min，最后增加到98% B溶液；质谱条件：前体离子扫描模式中，选择负离子扫描模式时，碰撞能量从‑30 到‑45eV；选择正离子扫描模式时，碰撞能量从+30 到+50eV；通过增强子离子扫描模式获得碎片离子光谱以确定类脂 A 的结构信息。

【技术特征摘要】
1.一种液质联用分析内毒素类脂A的方法，它包括下列步骤：S1.菌株处理：将干燥的细菌细胞均匀悬浮在水溶液中，控制细胞浓度1mg/mL，细胞定量后低压10-13pa冷冻-40℃～-50℃干燥处理；S2.萃取内毒素类脂A：将冷冻干燥后的细胞进行水解反应，待冷却0-25℃后将混合物离心，在清洗后的沉淀物中加入体积比为4:4:1的氯仿、甲醇、醋酸铵混合溶液，离心，收集上清液，用氮气吹干；S3.液质联用分析：色谱条件：酰胺柱内径0.3mm，长度10cm；流动相A：10mM醋酸铵的水溶液；流动相B：含有10mM醋酸铵的96%体积比四氢呋喃溶液；流速：50μL/min；洗脱梯度：98%体积比B溶液3－5min，随后18－22min逐渐降至70%体积比B溶液，维持70%B溶液9－11min，最后增加到98%B溶液；质谱条件：前体离子扫描模式中，选择负离子扫描模式时，碰撞能量从-30到-45eV；选择正离子扫描模式时，碰撞能量从+30到+50e...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡锐，杨运煌，蒋滨，刘买利，
申请(专利权)人：中国科学院武汉物理与数学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42