经微生物学方法制备假单胞菌酸A抗生素的方法技术

公开用于制备假单胞菌酸Ａ的方法，方法包括在通气的条件下深层培养能够生物合成假单胞菌酸Ａ的假单胞菌菌株；且分离要求的化合物。本发明专利技术方法特别包括在大约２０℃至大约３０℃之间的温度下，于含有有机氮和碳源和任选含有矿物盐的培养基上，培养保藏于布达佩斯匈牙利国立农业和工业微生物收藏中心的假单胞菌菌株１９／２６号，保藏号为ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ００１２３５，或它的产生假单胞菌酸Ａ突变型或变种。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于制备抗生素假单胞菌酸A(Pseudomonic acid A)(莫匹罗星)的微生物学方法。假单胞菌酸A的化学结构测定如由式(I)描述的那样，为9-{4-3-甲基丁-2(E)-烯酰氧基}壬酸 已知荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)能够产生假单胞菌酸A。按英国专利1,395,907号，荧光假单胞菌NCIB 10586菌株能够生物合成由假单胞菌酸A和它的在C2和C3碳原子之间的双键处于顺式位置的异构体和假单胞菌酸B组成的假单胞菌酸复合体。成分比例为4.5∶4.5∶1。然而，按照日本专利申请52-70083号，荧光假单胞菌Y-11633菌株能够生物合成由以9∶0.5∶0.5的比例存在的假单胞菌酸A、假单胞菌酸B和另外两种具有未知结构的成分组成的假单胞菌酸复合体。本专利技术也涉及在深层通气的条件下能够生物合成假单胞菌酸A的假单胞菌培养物，其基本上由新的假单胞菌属菌株19/26号组成。本专利技术还涉及新的假单胞菌属菌株19/26号的生物纯的培养基。图的简述附图说明图1为假单胞菌属菌株19/26号(NCAIM(P)B001235)产生的假单胞菌酸复合体的HPLC色谱图。专利技术详细描述在寻找细菌产生的抗微生物抗生素过程中，在含有为预防真菌生长的10μg/ml对羟苯乙基三甲基铵和5μg/ml环己酰亚胺的营养琼脂培养基上，分离到20,000种微生物。在不同的革兰氏阳性和革兰氏阴性试验微生物上，检查所分离的菌株的摇瓶培养基的抗菌有效性和它们对治疗实践中出现的对抗生素抵抗的变种。通过应用抗生素抵抗的试验微生物，我们想促进识别具有新的作用模式的抗菌抗生素。在上述的检查过程中，选择了称作“菌株19/26号”的细菌分离物。最初，已从阿根廷收集的土壤样品得到该微生物。其培养液分别对枯草酸杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633、金黄色葡萄球菌SMITH、耐青霉素金黄色葡萄球菌1110、未编号的肺炎链球菌菌株、化脓链球菌A 115 ROBB、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)140001、支气管败血性博代氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)ATCC 4617、克雷伯氏肺炎杆菌ATCC10031、耐美他西林和耐氨基糖苷类的金黄色葡萄球菌MRSA 1190R和两种未编号的肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)和流感嗜血杆菌菌株具有明显的抗菌作用。之后，从菌株19/26号的培养液分离到其抗菌代谢产物，且化学结构分析结果发现与假单胞菌酸A一致。同时，对选择的产生假单胞菌酸A的菌株进行分类研究。首先，使用装配ID 32 GN条的Bio-Merieux ATB表达，用选择的密切相关的菌株进行初步比较研究。后者适宜于相对快(如属的水平)的所给出的未知菌株的分类鉴定方法，如果它的诊断性质能够显示出所需的与至少一种这些被确认的菌株的高度表型相似性，这些被确认的菌株加入在设备的数据库中。用这个设备分别对14种不同的糖和14种有机酸的32次试验，能够测定所研究的未知菌株碳源利用图谱，加入到一种用生长因子复合体完全的基本培养基中。在接种和经过48小时孵育时间后，借助自动浊度测量法，在标明生长强度(反应)分别为+或-或？的发育微量培养上，进行利用试验结果评价。通过设备软件，评价同步研究的生物化学试验结果。所得到的菌株19/26号的生理学-生物化学数据与数据库中列出的菌株数据相一致(在该情况中，这样的菌株总数为114种，其中有14种属于不同的假单胞菌种类铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)I和II、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、荧光假单胞菌I和II、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、嗜温假单胞菌(Pseudomonas mesophilica)、皮氏假单胞菌(Pseudomonas pickettii)、类鼻疽假单胞菌(Pseudomonaspseudomallei)、泡囊假单胞菌(Pseudomonas vesicularis)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和旋氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri))。按照这个相关实验的结果，证实菌株19/26号为假单胞菌属的一个成员。在菌株19/26号的属的水平上成功鉴定后，我们尝试借助经典分类研究方法在种的水平上鉴定它。在以非孢子形成的革兰氏阴性杆菌的形式存在的适宜的固体培养基上，菌株19/26号的培养基能够增加0.6-1.1至1.3-4.0微米。这些是靠极性鞭毛主动游动的。这些专性需氧的化能有机营养杆菌仅能够氧化侵蚀(attack)葡萄糖。它们不能发酵且不能用硝酸盐作为末端电子受体被修复，但显示阳性催化酶反应。它们在简单的合成培养基上不能发展可见菌落且对它们的增殖总是需要生长因子。在最佳条件下生长，它们的菌落呈精氨酸二水解酶阳性，产生荧光色素但在细胞中不能检测多-β-羟基-丁酸盐的存在和聚集。菌株19/26号的其它特征如下在41℃下不能观察到它的菌落发展；它从蔗糖中不产生果聚糖，不水解明胶和淀粉，其呈氧化酶阳性，且不利用葡萄糖、2-酮基-葡糖酸盐、海藻糖和内消旋肌醇作为单一碳源。所有这些诊断性质将假单胞菌菌株19/26号与以下菌种清楚地分开铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、绿叶假单胞菌、致金色假单胞菌、丁香假单胞菌、绿黄假单胞菌、菊苣假单胞菌、旋氏假单胞菌、门多萨假单胞菌、产碱假单胞菌、类产碱假单胞菌和恶臭假单胞菌。菌株19/26号能够仅在用(0.2-1.0％)酵母提取物、玉米浸渍液或其它的含有不同种类生长因子的复合天然营养物制备的培养基上进行培养。在这些特殊诊断性质的基础上，认为菌株19/26号能够属于所谓“非典型假单胞菌种”有机体。这样的“非典型假单胞菌种”未来可加入到新建立的细菌分类群中(N.J.Palleroni，“Psuedomonaceae”Bergeys Manual of Systematic Bacteriology，1，141-219，N.R.Krieg和J.G.Holt编辑，BaltimoreWilliams and Wilkins，1984)。菌株19/26号于1996年7月16日保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心，保藏号为NCAIM(P)B 001235。按照本专利技术优选方法，以保藏号NCAIM(P)B 001235保藏的假单胞菌属菌株19/26号用于制备基本纯的假单胞菌酸A。所选择的菌株能够使用蛋白胨、牛肉膏、玉米浸渍液、酵母提取物、酪蛋白和大豆粉作为氮源。除以上氮源以外，碳源例如葡萄糖、甘油和葵花油能够以不同的组合使用。尽管天然来源的培养基成分含有无机盐，向接种培养基中加入一些无机盐(例如铵、钙、铁、锌、铜、镁、锰、钠或钾盐)仍是有利的。优选硫酸镁、二氯化锰、硫酸亚铁、氯化锌、硫酸铜II、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钠和碳酸钙。在4℃下，在含有蛋白胨-酪蛋白的斜面琼脂培养基上进行菌株的维持，每两周将它新鲜转移。为维持假单胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备假单胞菌酸Ａ的方法，包括以下步骤在深层通气的条件下，于包含至少一种有机氮或碳源的培养基上培养能够生物合成假单胞菌酸Ａ的假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌株，和发酵假单胞菌培养物以便形成假单胞菌酸Ａ，其中所述假单胞菌 菌株为保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心的假单胞菌属菌株１９／２６号，保藏号为ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ００１２３５。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：V斯泽尔，I朗，I巴塔，A特格德斯，K阿尔布雷希特，J莫泽斯尼苏托，IM沙波，M佩特罗茨基，J埃戴，E古尔雅斯，G巴洛，
申请(专利权)人：V斯泽尔，I朗，I巴塔，A特格德斯，K阿尔布雷希特，J莫泽斯尼苏托，IM沙波，M佩特罗茨基，J埃戴，E古尔雅斯，G巴洛，
类型：发明
国别省市：HU[匈牙利]