Talaromyces emersonii的β-葡聚糖酶制造技术

本发明专利技术公开了能降解植物提取物或植物材料中的纤维素并具有（内切）β－１，４－葡聚糖酶活性（ＥＣ３．２．１．４）的３个新多肽。因此它们是纤维素酶，并能切割β－Ｄ－葡聚糖聚合物内部相邻葡萄糖单位之间的（１－３，１－４或１－６）键。给出了获自Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｅｍｅｒｓｏｎｉｉ真菌菌株的所有３个葡聚糖酶（ＣＥＡ，ＣＥＢ和ＣＥＣ）的氨基酸序列和编码ＤＮＡ序列。该葡聚糖酶可在食品和动物饲料的制造中用于处理纤维素。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及来自踝节菌属(Talaromyces)真菌、尤其是Talaromycesemersonii的(β-)葡聚糖酶(因此也涉及纤维素酶)，以及它们用于降解纤维素中葡聚糖的用途。
技术介绍
植物细胞壁的组成是复杂和多变的。多糖主要以纤维素(植物细胞壁的主要结构成分)、半纤维素(包含各种β-木聚糖链，如木葡聚糖(xyloglucan))和果胶长链形式存在。β-葡聚糖(或，更适当地，(1→3)(1→4)β-D-葡聚糖)，MW为10至14kDa，是植物半纤维素(MW为约700kD-a)的成分，由β-1，4和1，3-连接的吡喃型葡萄糖残基主链组成。另一成分是木聚糖，其由β-1，4连接的木糖残基组成，该木糖残基任选地被侧链如阿拉伯糖和/或葡糖醛酸残基取代。单子叶植物(例如谷物和草)和双子叶植物(例如苜蓿、油菜籽和大豆)之间以及植物的种子和营养部分之间有着根本差异。单子叶植物的特征在于存在阿拉伯木聚糖复合物作为主要的半纤维素主链，而双子叶植物中半纤维素的主要结构是木葡聚糖复合物。双子叶植物中比单子叶植物中有较高的果胶浓度。种子通常具有高的果胶物质但相对低的纤维素物质。由于能够作用于主要的植物细胞壁成分，纤维素降解酶被用于加工食物中的植物材料以及用于饲喂用途或作为食物或饲料添加剂。工业上目前使用的大多数纤维素降解酶表现为是分子量相对低且较高温度下具有中等稳定性的葡聚糖酶。然而，对于某些应用，可能期望使用具有相对高热稳定性的葡聚糖酶。由于在制备动物饲料球团过程中要应用高的温度条件，所以在使用葡聚糖酶作为动物饲料添加剂时优选高的热稳定性。专利技术概述现提供新的β-葡聚糖酶(或纤维素酶)，其能够切割β-D-葡聚糖(或纤维素)如存在于植物材料中的那些。最广义上讲，本专利技术涉及来自踝节菌属，如Talaromyces emersonii(真菌)的β-葡聚糖酶(或纤维素酶)。这些β-葡聚糖酶可以切割β-D-葡聚糖或纤维素，例如它们可以是β-1，4-内切葡聚糖酶，或具有EC3.2.1.4的活性。这些葡聚糖酶可以具有a.低于7.0或5.4，如低于5.0、如4.4至5.2或3.0至6.0或7.0的最适pH；或b.至少72℃、75℃或甚至81℃，如78℃至85℃或83℃至87℃的最适温度。更具体地，本专利技术提供(分离的)β-葡聚糖酶多肽，其包含(i)SEQ ID-NO2、4或6的氨基酸序列；或(ii)能够切割β-D-葡聚糖的(i)的变体；或(iii)能够切割β-D-葡聚糖的(i)或(ii)的片段。根据本专利技术的另一方面，提供如下多核苷酸，其包含(a)SEQ ID NO1、3、或5的核酸序列，或编码本专利技术多肽的序列；(b)可与(a)所定义的任何序列互补或杂交的序列；(c)(a)或(b)中任何序列的片段；(d)与(a)、(b)或(c)所定义的任何序列有至少60％一致性的序列；或(e)由于遗传密码的原因而与(a)至(D)所定义的任何序列简并的序列。本专利技术还提供- 包含本专利技术多核苷酸并能够表达本专利技术多肽的(如表达)载体；- 包含本专利技术载体的细胞系或细胞株；- 制备本专利技术多肽的方法，该方法包括在适于实现该多肽表达的条件下维持本专利技术的细胞系或细胞株，和如果必要的话分离该多肽；- 降解β-D-葡聚糖的方法，该方法包括使包含β-D-葡聚糖的材料和本专利技术多肽接触；- 鉴定可调节β-葡聚糖酶活性的化合物的方法，该方法包括使本专利技术多肽与测试化合物在β-D-葡聚糖存在的情况下接触并监测或检测活性的任何改变。- 治疗患有高脂血症的患者的方法，该方法包括给患者使用有效量的本专利技术多肽；和- 该多肽在制备用于治疗或预防高脂血症的药物中的用途。序列简述SEQ ID NO1是来自Talaromyces emersonii的本专利技术第一β-葡聚糖酶(CEA)的DNA序列；SEQ ID NO2是此第一β-葡聚糖酶CEA的氨基酸序列；SEQ ID NO3是来自相同生物的第二β-葡聚糖酶(CEB)的DNA序列；SEQ ID NO4是此第二β-葡聚糖酶CEB的氨基酸序列；SEQ ID NO5是也来自相同生物的第三β-葡聚糖酶(CEC)的DNA序列；SEQ ID NO6是此第三β-葡聚糖酶CEC的氨基酸序列；和SEQ ID NO7和8是可与SEQ ID NO1杂交的PCR引物(被用于在遗传分析阳性转化体过程中再次克隆cDNA插入片段)。专利技术详述A.多核苷酸本专利技术提供编码本专利技术多肽的(例如分离的和/或纯化的)多核苷酸。因此，本专利技术提供编码具有SEQ ID NO2、4或6的氨基酸序列的β-葡聚糖酶的多核苷酸。本专利技术还提供编码具有与SEQ ID NO2、4或6的氨基酸序列实质上同源的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。本专利技术还包括选自以下的多核苷酸(a)包含SEQ ID NO1、3、或5所示核苷酸序列或它们的互补序列的多核苷酸；(b)包含能够与SEQ ID NO1、3、或5所示核苷酸序列或它们的片段(例如选择性地)杂交的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含能够与SEQ ID NO1、3、或5所示核苷酸序列或它们的片段的互补序列(例如选择性地)杂交的核苷酸序列的多核苷酸；和/或(d)包含由于遗传密码的原因而与(a)、(b)或(c)所定义的多核苷酸有简并性的多核苷酸序列的多核苷酸。本专利技术多核苷酸也包括如下多核苷酸，其(a)编码具有β-葡聚糖酶活性的多肽，该多核苷酸是(1)SEQ ID NO1、3或5的编码序列；(2)选择性地与(1)定义的序列的互补序列杂交的序列；或(3)由于遗传密码的原因而与(1)或(2)定义的序列有简并性的序列；或(b)是与(a)定义的多核苷酸互补的序列。可杂交的序列术语“可以杂交”意味着本专利技术靶多核苷酸可以和用作探针的核酸(例如SEQ ID NO1、3或5所示核苷酸序列，或其片段，或它们的互补序列)以显著高于背景的水平发生杂交。本专利技术还包括编码β-葡聚糖酶或其变体的核苷酸序列以及与其互补的核苷酸序列。该核苷酸序列可以是RNA或DNA，并因此包括基因组DNA、合成的DNA或cDNA。优选地，该核苷酸序列是DNA序列，最优选cDNA序列。典型地，本专利技术多核苷酸包含(如果适当的话)能够在选择性条件下与SEQ ID NO1、3或5的编码序列或该编码序列的互补序列杂交的连续核苷酸序列。这些核苷酸可以根据本领域熟知的方法合成1。本专利技术多核苷酸可以(如果适当的话)与SEQ ID NO1、3或5的编码序列或编码序列的互补序列以显著高于背景的水平杂交。背景杂交可以由例如cDNA文库中存在的其它cDNA引起。信号水平(例如通过本专利技术多核苷酸和SEQ ID NO1、3或5的编码序列或编码序列的互补序列之间的相互作用产生的)典型地是其它多核苷酸与SEQ ID NO1、3或5的编码序列之间的相互作用的强度的至少10倍、优选至少100倍。相互作用的强度可以通过例如放射性标记探针(如用32P)来测量。选择性杂交可以典型地使用低严紧条件(0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约40℃)、中等严紧条件(例如，0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约50℃)、或高严紧条件(例如，0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约60℃)实现。杂交可以在本领域已知的任何适当的条件1下进行，作为一个说明，低严紧性可本文档来自技高网...

【技术保护点】
多肽，其是获自踝节菌属真菌，如真菌Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ的具有ＥＣ ３．２．１．４活性（内切葡聚糖酶活性）的β－葡聚糖酶。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JPTW范登哈姆伯格，JM范德兰恩，JMG达兰，MA赫威基尔，DP托伊费尔，
申请(专利权)人：DSM公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]