一种克服滞后污染的PCR方法技术

一种能克服滞后污染的聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括：　　　　（１）用限制性内切酶处理ＰＣＲ反应液；　　　　（２）ＤＮＡ模板变性解链；　　　　（３）引物与模板退火；　　　　（４）在ＤＮＡ聚合酶催化下延伸合成互补ＤＮＡ链；　　　　（５）按步骤（２）－（４）循环进行合成反应；　　　　在设计正引物或者反引物时引进错配碱基，使扩增产物含有目标基因所没有的限制性内切酶识别顺序。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学技术，特别是涉及聚合酶链式反应方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种快捷、高效的扩增特定DNA的方法。根据PCR的基本原理经过25-30循环扩增目标基因片段将增加800万至2亿5千万倍。由于扩增产物和样品中的目标基因均可作为扩增模板，痕迹量乃至几个拷贝扩增产物DNA片段的滞后污染，即会造成比交叉污染严重得多的麻烦。为了减少滞后污染的机会通常需采取严格的物理防范措施(J.L.Hartley等，PCR Method andapplications，1993，3，S10-S14)，例如将PCR反应液制备区与PCR产物检测区分开甚至分二个房间，应用专门的PCR操作箱和专用的移液管，应用带气雾阻挡物的PCR专用移液头，用特制的能破坏DNA的试剂清洁操作台表面及各种器具等等。为了减少气流振荡造成微量反应液扩散，有人甚至主张在PCR反应完成后，先将试管冷冻至液体结成冰，然后再打开管盖。各种物理措施尽管必要，但滞后污染仍防不胜防，为此发展了各种化学和生物化学方法，如光敏DNA交联剂、核酸酶和脱氧尿嘧啶糖苷酶(UDG)方法等。至今，在试剂盒中被采用的是UDG方法，该方法(M.C.Longo等，Gene，1990，125-128)用特殊核苷酸dUTP取代4种核苷酸底物中的dTTP，使扩增产物带有尿嘧啶。PCR反应前用脱氧尿嘧啶糖苷酶分解可能存在于反应液中的滞后污染扩增产物。该方法的严重缺点是由于扩增产物带有大量非天然的碱基，PCR产物不适宜用于克隆等目的。90年代初有科学家提出用核酸酶和能切割扩增产物顺序的一种或几种限制性内切酶处理反应液，能有效去除可能存的滞后污染扩增产物(F.M.deFlilippes，BioTechniques，1991，1026-29和B.Furrer等，Nature，1990，346324)，但必须在酶处理之后再向反应液加样品DNA，否则目标基因DNA也会被酶切割而导致扩增失败。由于样品本身也可能带有滞后污染扩增产物，这种方法形同虚设，实际上难以实施。本专利技术提出了一种有效而可实际操作的用限制性内切酶减少和消除滞后污染的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题本专利技术提供一种克服滞后污染的PCR方法，以填补目前通过引物设计和常规限制性内切酶处理的方法解决滞后污染问题的空白，解决现有技术中克服滞后污染需专用试剂和酶、操作复杂、产物无法进行克隆的缺陷。专利技术构思本专利技术的原理鉴于在引物的适当位置中引进一个或若干个错配碱基，引物仍能在较高的退火温度下专一地完成扩增，同时，扩增产物又带有一个目标基因所不含有的限制性内切酶识别顺序。在每一次PCR反应前用特定的限制性内切酶处理反应液，就可分解可能存在的滞后污染扩增产物，但又不伤及样品DNA中的目标基因。被限制性内切酶分解的扩增产物，因为在它的正、反链的5’端各失去了一个约十个碱基的片段，在设定的PCR退火温度下不再能与引物结合，失去了作为模板的功能。技术方案本专利技术提供一种能克服滞后污染的聚合酶链式反应方法，其步骤依次包括(1)用限制性内切酶处理PCR反应液；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；特别地，在设计正引物或者反引物时引进错配碱基，使扩增产物含有目标基因所没有的限制性内切酶识别顺序。优选正、反引物同时引进错配碱基。上述的聚合酶链式反应方法的一个技术方案为，在引物中引进的错配碱基数为1-8个，优选1-3个。上述的聚合酶链式反应方法的另一个技术方案为，在引物中引进的错配碱基位于引物3’或5’端起5-25碱基，优选位于引物3’或5’端起10-15碱基。上述的聚合酶链式反应方法的另一个技术方案为，引进错配碱基的引物具有1-6个限制性内切酶切点，优选具有2-4个限制性内切酶切点，这些内切酶的识别顺序碱基数为4-8个，优选的识别顺序碱基数为6个。上述的聚合酶链式反应方法的另一个技术方案为，所说的限制性内切酶为产生平末端、3’粘性末端或者5’粘性末端的酶。上述的聚合酶链式反应方法的另一个技术方案为，引进的错配碱基在限制性内切酶的识别顺序中近5’端的位置。下面通过一些计算和测试分析结果来说明本专利技术的原理和普遍可用性。首先以全长1800多碱基的人肌动球蛋白基因为例进行分析，说明在引物的中间位置有一个碱基突变对引物功能的影响，和从该位置开始去除5’端片段碱基对引物功能的影响。测试时每间隔100个碱基取一段30碱基寡核苷酸作为正引物，然后分析在3’端数起的第12个碱基发生A与T，或C与G的碱基置换后，引物与模板的结合强度及解链温度变化，并与去除第12位以后的5’端碱基的数据进行比较。用引物软件Oligo6测算结合强度和解链温度。表1列出每一个项目17个数据的统计结果。表1.错配碱基和去除一段碱基对引物特性的影响 *最邻近碱基计算法**在引物软件设定的标准PCR反应液条件下的解链温度表1说明30碱基长引物与模板的平均结合强度超过570，如果在引物的3’端第12位引进一个碱基突变，则平均结合强度仍达450，远远超过一个高严谨性引物对该项指标的要求。反之，如果模板在该位置以后的5’端被切除，则引物与模板的结合强度下跌至308。另一方面，30碱基长引物的平均解链温度为86℃，最高允许退火温度超过72℃。引物引进一个突变后解链温度下降约4℃，仍能在接近或高于72℃的高温下退火。但是当模板的5’端顺序被切割后，引物与模板的最高允许退火温度平均下降至45℃(根据标准PCR条件下的Tm计算)。所以，在30碱基长引物的第12位引进一个突变，使之形成一个限制性内切酶识别顺序。如用该限制性内切酶处理PCR反应液，酶对目标基因不切割。引物与原始目标基因模板虽有一个错配，但仍能在高温下与之退火完成扩增。滞后污染扩增产物的5’端会被限制性内切酶分解，形成5’端缺失十几个碱基的不完整模板，在同样的温度下引物不能与之退火，滞后污染扩增产物就丧失了模板的作用。为了理解该方法的普遍应用性，分析在人肌动球蛋白基因中引入一个碱基错配后，能产生多少新增加的限制性内切酶识别顺序。以最常用的识别顺序为六个碱基的六种限制性内切酶BamHI，EcoRI，HindIII，PstI，SalI和XhoI为例进行分析。限制性内切图谱表明这六个酶在该基因中均无切割位点。但是只要改变一个碱基就能产生许多新的被酶切割的位点。分析结果示于表2，粗黑体表示该硷基被取代后能产生一个酶识别顺序。表2.改变一个碱基后新增的限制性内切酶的识别位点 表2说明在长1880多碱基的基因中，对指定的六种识别顺序为6个碱基的限制性内切酶，只要改变一个碱基就能产生36个新增的识别顺序，平均每个酶能找到6个位点。常用的限制性内切酶有几十种，能找到的总位点数将数以百计。如果将错配碱基数放宽到2或3个，新增的限制性内切酶识别位点数将大大增加。有益效果本专利技术提供的通过引物设计和常规限制性内切酶处理克服滞后污染的PCR方法，填补了目前解决滞后污染问题上的空白，其有益效果除其他方法也能达到的完全分解污染片段外，其独特之处还在于；1，本专利技术的方法是在下一轮PCR反应之前而不是PCR反应结束时采取防本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐定邦，朱德芬，谢文凯，徐文慧，
申请(专利权)人：徐定邦，徐文慧，
类型：发明
国别省市：