DNA的合成方法技术

ＤＮＡ合成反应促进剂，它至少含有１种选自酸性物质和阳离子络合物的物质；ＤＮＡ合成方法，它是在上述促进剂存在的情况下应用ＤＮＡ聚合酶进行的ＤＮＡ合成反应；ＤＮＡ合成反应促进剂，它包含上述促进剂；ＤＮＡ合成反应组合物，它至少含有２种具有３′→５′核酸外切酶活性的ＤＮＡ聚合酶；ＤＮＡ合成方法，它在进行ＤＮＡ合成反应时应用了至少２种具有３′→５′核酸外切酶活性的ＤＮＡ聚合酶；用于体外合成ＤＮＡ试剂盒，它至少包含２种具有３′→５′核酸外切酶活性的ＤＮＡ聚合酶；用于体外合成ＤＮＡ的试剂盒，它包含上述ＤＮＡ合成反应促进剂和ＤＮＡ聚合酶。因此可以比传统的ＤＮＡ合成反应更有效地合成ＤＮＡ。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程学领域中有用的DNA合成反应促进剂。DNA合成方法、DNA合成反应组合物及用于该DNA合成方法的试剂盒。
技术介绍
在基因工程学领域的研究中，DNA的合成可用于各种不同的目的。其中除了合成象寡核苷酸那样的短链DNA之外，基本上是通过利用DNA聚合酶的酶学方法来合成的。因此，作为DNA碱基序列测定、DNA标记或导入位点特异的突变的试剂，DNA聚合酶具有很高的价值。最近，由于聚合酶链式反应(PCR)方法和该PCR方法与逆转录酶反应相结合的逆转录-PCR(RT-PCR)方法的开发，人们的注意力集中在耐热性DNA聚合酶上，开发出适于上述PCR方法的各种DNA聚合酶，并使之商品化。现在已知的DNA聚合酶根据其氨基酸序列的同源性可分为四大家族，其中家族A(polI型酶)和家族B(α型酶)占据了大多数。属于同一家族的各DNA聚合酶有大致相同的生化学特性，但是详细比较时，各种酶有其不同的性质，如基质特异性、基质类似物的摄取效率、引物延长的强度及速度、DNA合成方式、核酸外切酶活性、温度、pH等最佳反应条件、或对抑制剂的敏感性等。因此，要从目前可能的DNA聚合酶中选择应用具有最佳适用性质的。例如超耐热性古细菌(Pyrocuccus furiosus)生产α型DNA聚合酶，已经分离出其基因(核酸研究(Nucleic Acids Research)，第21卷，259-265页(1993))。最近，在该菌株中发现一新型与目前已知的DNA聚合酶不存在结构相似性的DNA聚合酶。该DNA聚合酶是2种新型的蛋白质形成的复合体，表达DNA聚合酶活性。此外，该新型DNA聚合酶有强的3′→5′核酸外切酶活性并显示良好的引物延长活性。例如在PCR中应用该酶时，可扩增20kb长度的DNA片段。另一方面，应用DNA聚合酶的DNA合成反应中，选择合适的酶与设定合适的反应条件同样重要。主要的反应条件包括反应液的组成、pH、反应温度、模板及引物的浓度等。而且，必须设定所使用的酶及与目的相应的反应条件。但是，有时这样的设定很困难。已知，联合应用多个DNA聚合酶时可合成单个DNA聚合酶所不可能达到的高效DNA〔美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad Sci.US)，第91卷，第5695-5699(1994)〕。该方法是在PCR中混合使用具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶(例如上述Pyrococcus furiosus来源的α型DNA聚合酶)和没有该活性的DNA聚合酶(Taqpolymerase)〕的方法，称之为LA-PCR法。与以往只应用1种DNA聚合酶的PCR相比，该方法可增加扩增出的DNA的量，并且它能扩增以往的PCR所不能扩增的长链长DNA。但是，该效果只限于联合应用上述具有3′→5′核酸外切酶活性的酶和不具有该活性的酶时发挥作用。如上所述，应用DNA聚合酶的DNA合成反应是基因工程学方法中所必不可缺少的手段。增加其效率对于提高研究的效率是很重要的。但是，现在应用的反应体系的缺点是它在研究应用中未得到充分优化。因此就要寻求与目前的DNA合成反应相比能更有效合成DNA的方法。
技术实现思路
本专利技术借鉴于以往的技术，其目的是提供(1)DNA合成反应促进剂，(2)以在该DNA合成反应促进剂存在的条件下进行反应为特征的DNA合成方法，(3)含有该DNA合成反应促进剂的DNA合成反应组合物，(4)含有2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的DNA合成反应组合物，(5)以在进行DNA合成反应时，应用了2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶为特征的DNA合成方法，(6)含有2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的试剂盒，以及(7)含有上述DNA合成反应促进剂及DNA聚合酶的试剂盒。本专利技术者们进行了专心研究，结果发现至少1种选自酸性物质和阳离子络合物的物质存在时可提高DNA聚合酶的DNA合成反应的效率。另外发现当2种以上具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶混合使用时能使DNA的合成效率极高。而且，这些技术联合应用时可构建良好的基因扩增反应体系，这些组成了本专利技术。也就是说，本专利技术的要点是，它涉及含有至少1种选自酸性物质和阳离子络合物的DNA合成反应促进剂；DNA合成方法，其特征在于，进行DNA合成反应时，在上述(1)中的DNA合成反应促进剂存在的条件下应用DNA聚合酶进行；含有上述(1)中DNA合成反应促进剂的DNA合成反应组合物；含有2种或更多种具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶的DNA合成反应组合物；DNA合成方法，其特征在于，进行DNA合成反应时它应用了2种或更多种具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶；用于体外合成DNA的试剂盒，它含有2种或更多种具有3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶，以及用于体外合成DNA的试剂盒，它含有上述中的DNA合成反应促进剂及DNA聚合酶。实施本专利技术的最佳方案(1)本专利技术的DNA合成反应促进剂本专利技术的DNA合成反应促进剂的一个大特征是它至少含有1种选自酸性物质及阳离子络合物的物质。本专利技术的DNA合成反应促进剂因含有至少1种(有效成分)选自酸性物质及阳离子络合物的物质，能发挥促进DNA聚合酶引起的DNA合成反应的作用。本专利技术的“DNA合成反应促进剂”是单指上述酸性物质或阳离子络合物的，或者是含有酸性物质和阳离子络合物的混合物，每种均能显示促进DNA合成反应之作用。另外，当酸性物质与阳离子络合物形成复合体时，只要它能促进DNA聚合酶的DNA合成反应，也包含在本专利技术的“DNA合成反应促进剂”之内。再者，在发挥促进DNA聚合酶的DNA合成反应的作用范围内添加了各种添加剂的混合物也包含在本专利技术的“DNA合成反应促进剂”中。“促进DNA合成反应的作用”可通过单位时间内新合成的DNA链的长度及PCR扩增产物的量进行检测。另外，DNA聚合酶的活性测定可以，例如进行新合成的DNA链所摄取的标记核苷酸的活性测定时，可通过比较添加或未添加至少1种选自酸性物质及阳离子络合物的物质时的活性进行测定。所讲的“促进DNA合成反应的作用”也包含提高合成反应效率的作用。作为本专利技术的DNA合成反应促进剂没有进行特殊限定，例如作为DNA聚合酶活性促进剂可以是作用于DNA聚合酶提高其催化活性的物质；或者该促进剂的有效成分的分子上保持DNA聚合酶，从而抑制酶与模板DNA的非特异性相互作用，提供模板DNA最适量的酶；或作用于模板DNA，通过保持其主体结构达到易于DNA合成反应进行的状态而有效发挥该DNA聚合酶的活性。另外，本专利技术的DNA合成反应促进剂的另一作用是能提高模板DNA和引物的退火效率。上述DNA合成反应促进剂中的酸性物质，作为DNA聚合酶活性促进，它是具有促进DNA合成反应作用的物质，具体而言，它是带有负电荷的物质或其盐类，特别是酸性物质或其盐类等。本专利技术的DNA合成反应促进剂中应用酸性物质时，它能在DNA合成反应的进行过程中通过使发生扩增的模板DNA与DNA聚合酶的相互作用最优化而促进DNA合成反应。对有DNA合成反应促进作用的酸性物质包括但不局限于，例如酸性多糖样的酸性高分子物质。另外，也可应用聚乙烯硫酸、聚苯乙烯硫酸、聚谷氨酸、聚丙烯酸、没有模板功能的D本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＤＮＡ合成反应组合物，它含有２种以上具有３′→５′核酸外切酶活性的ＤＮＡ聚合酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：浅田起代蔵，上森隆司，佐藤好美，藤田朋子，三宅一惠，武田理，向井博之，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[]