一种茼蒿抑菌活性单体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种茼蒿抑菌活性单体及其使用方法，属于活性物质的分离及使用方法技术领域，该茼蒿抑菌活性单体通过茼蒿茎叶预处理、浸提、大孔树脂柱层析、C18中压色谱分离、葡聚糖凝胶LH‑20柱层析、半制备液相分离处理。本发明专利技术所提出一种茼蒿抑菌活性单体，其能够提取高效的抑菌活性的单体，可以很好地抑制西瓜枯萎病菌，具有良好广阔的应用前景。

A chrysanthemum antibacterial monomer and method of use thereof

The invention discloses a chrysanthemum antibacterial activity monomer and use method thereof, belonging to the technical field of active material separation and method of use, the antibacterial activity of monomer by chrysanthemum chrysanthemum stem leaf pretreatment, extraction, macroporous resin column chromatography, C18 medium chromatography, Sephadex LH 20 column chromatography and semi preparation the liquid phase separation process. The invention provides a chrysanthemum antibacterial monomer, monomer capable of extracting effective antibacterial activity, can effectively suppress Fusarium wilt, has a good application prospect broad.

【技术实现步骤摘要】
一种茼蒿抑菌活性单体及其使用方法
本专利技术涉及活性物质的分离及使用方法
，更具体的，涉及一种茼蒿抑菌活性单体及其使用方法。
技术介绍
西瓜枯萎病(WatermelonFusariumwilt)又名蔓割病、萎凋病、萎蔫病，被称为“西瓜癌症”，由半知菌亚门真菌—西瓜尖镰孢菌[Fusariumoxysporumf.sp.niveum(E.F.Smith)Wollen]侵染所致，是国内外普遍发生的一种毁灭性的土传病害。由于西瓜栽培面积迅速扩大，导致重茬西瓜面积增多，西瓜枯萎病的发生日趋普遍和严重，给西瓜生产带来巨大的经济损失和资源浪费。枯萎病可造成西瓜产量下降30％～40％，重病地块减产80％以上，甚至绝产。因此，西瓜枯萎病的有效防治，直接影响到西瓜产业的健康发展。长期以来，人们主要通过农业防治、抗病育种、生物防治、化学防治等方法防治西瓜枯萎病。化学防治具有见效快、效果好的特点。各地对西瓜枯萎病的药剂防治工作都比较重视，筛选和研制出了一批具有一定防效的化学药剂，如菌毒清、KT乳剂、甲霜灵锰锌、恶霉灵、40％瓜枯宁等对西瓜枯萎病都有一定的防治效果。随着科学技术的进步和检测分析手段的完善，发现过去认为安全的一些化学杀菌剂有致癌或潜在致癌、致突变、致畸的可能性。另外，长期使用化学杀菌剂，容易使病原菌对其产生抗药性，降低防治效果，污染环境。公众对大剂量使用化学杀菌剂对生态环境和人体健康带来的危害也日益关注。因此，寻找广谱、高效、低毒、安全的杀菌剂，特别是从天然植物中研究和筛选具有抑菌效果，对人体健康和生态环境无害的抑菌活性成分具有十分重要的意义。茼蒿(ChrysanthemumCoronariumL.var.SpatiosumBailer)是我国的传统菊科绿叶蔬菜，在南北各地均有栽培。现代药理研究表明，茼蒿具有抗菌、消毒、抗微生物、抗癌、降压、祛痰等多种生理活性。前茬种植茼蒿的地块，再种西瓜，西瓜长势良好，没有发生枯萎病，且西瓜产量和品质都有所提高。从茼蒿中分离出具有抑菌活性的单体，它可以开发成一种天然杀菌剂应用抑制西瓜枯萎病菌，具有良好广阔的应用前景。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题在于提出一种茼蒿抑菌活性单体及其使用方法，其能够提取高效的抑菌活性的单体，可以很好地抑制西瓜枯萎病菌，具有良好广阔的应用前景。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种茼蒿抑菌活性单体，包括以下步骤：S1：茼蒿茎叶预处理：称取新鲜的茼蒿茎叶20Kg，自然晾干后，于45-55℃鼓风干燥机中干燥10-14h，精确称取1.7-2.3Kg干燥后的茼蒿，于中药材粉碎机中粉碎，过40目筛；S2：浸提：加入48-52L的95％乙醇超声波辅助提取2-4次，每次1-3h，合并滤液减压浓缩，得到浸膏；S3：大孔树脂柱层析：浸膏溶解于1.1-1.3L蒸馏水中，过滤，上清液上于D101大孔树脂柱中，依次用蒸馏水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇和90％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱1.9-2.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，分别回收每个梯度洗脱后的洗脱液，进行减压回收得到六个馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，筛选出其中菌落直径最小对应的馏分A；所述D101大孔树脂柱的直径为3.0-5.0cm，大孔树脂柱长度为23-27cm；S4：C18中压色谱分离：取S3的A馏分经C18中压色谱(MPLC)分离，甲醇:水梯度洗脱，依次用5％甲醇、15％甲醇、25％甲醇、35％甲醇和50％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱0.8-1.2L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，各梯度洗脱后的洗脱液经HPLC检测，筛选合并相同馏分，形成不同梯度的B类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同B类馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，筛选菌落直径最小B类馏分中的一种，定义为B1馏分；S5：葡聚糖凝胶LH-20柱层析：将S4中B1馏分经SephadexLH-20凝胶柱层析分离，依次用5％甲醇、15％甲醇、25％甲和35％甲醇洗脱，每个梯度洗脱0.9-1.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，HPLC检测合并相同馏分，形成不同梯度的C类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同C类馏分的PDA培养基中，置于23-33摄氏度的恒温培养箱培养3-5d，筛选菌落直径最小的馏分，定义为C1馏分；S6：半制备液相分离：S5所得C1馏分经半制备液相分离，依次用18％甲醇、27％甲醇、36％甲和45％甲醇洗脱，每个梯度洗脱0.9-1.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，HPLC检测合并相同馏分，形成不同梯度的D类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同D类馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，菌落直径最小的馏分为茼蒿抑菌活性单体。在本专利技术较佳地技术方案中，S1中，将茼蒿茎叶于50℃鼓风干燥机中干燥12h，精确称取2.0Kg干燥后的茼蒿，于中药材粉碎机中粉碎，过40目筛。在本专利技术较佳地技术方案中，S2中，加入50L的95％乙醇超声波辅助提取3次，每次2h。在本专利技术较佳地技术方案中，S3中，浸膏溶解于1.2L蒸馏水中；每个梯度洗脱2L溶剂，流速3.0mL/min。在本专利技术较佳地技术方案中，S3中，所述D101大孔树脂柱的直径为4.0cm，大孔树脂柱长度为25cm。在本专利技术较佳地技术方案中，S4中，每个梯度洗脱1L溶剂，流速3.0mL/min。在本专利技术较佳地技术方案中，S5中，流速3.0mL/min，将培养基置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d。在本专利技术较佳地技术方案中，S6中，每个梯度洗脱1L溶剂，流速3.0mL/min，所述半制备液相使用的填料粒径为10μm，内径10mm，长度250mm。一种茼蒿抑菌活性单体的使用方法，将分离纯化得到的化合物用无菌水稀释为100mg·mL-1的原液，将其浇灌于西瓜幼苗根部的前3-5天，每天1次，之后每3-4天1次，再连续浇灌3-5次，每次浇灌8-12ml。在本专利技术较佳地技术方案中，将原液浇灌于西瓜幼苗根部的前5天，每天1次，之后每3天1次，再连续浇灌5次，每次浇灌10ml。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的茼蒿抑菌活性单体的分离纯化及其使用方法，先将干燥后的茼蒿粉碎，过40目筛，再进行乙醇超声波提取，合并滤液并减压浓缩，接着进行大孔树脂柱层析，甲醇洗脱，取抑菌效果最好的馏分，然后进行C18中压色谱分离，采用甲醇洗脱，通过HPLC检测合并相同馏分，再取抑菌效果最好的馏分，接着采用葡萄糖凝胶LH-20柱层析，甲醇洗脱，HPLC检测合并相同馏分，取抑菌效果最好的馏分，最后采用半制备液相分离，同样采用甲醇洗脱，HPLC检测合并相同馏分，经实验，菌落直径最小的馏分为所得茼蒿抑菌活性单体，通过多次的分离提纯，提取出高效的抑菌活性的单体，这种茼蒿抑菌活性单体属于天然杀菌剂，即使长期使用也不容易使病原菌对其产生抗药性，又对环境造成污染，且其对西瓜枯萎病菌具有很好的抑制作用，保护西瓜的生长。具体实施方式下面并通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案。下列实施例1至实施例3是从茼蒿茎叶中提取茼蒿抑菌活性单体的实验：实施例1：实施例1中提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茼蒿抑菌活性单体，其特征是包括以下步骤：S1：茼蒿茎叶预处理：称取新鲜的茼蒿茎叶20Kg，自然晾干后，于45‑55℃鼓风干燥机中干燥10‑14h，精确称取1.7‑2.3Kg干燥后的茼蒿，于中药材粉碎机中粉碎，过40目筛；S2：浸提：加入48‑52L的95％乙醇超声波辅助提取2‑4次，每次1‑3h，合并滤液减压浓缩，得到浸膏；S3：大孔树脂柱层析：浸膏溶解于1.1‑1.3L蒸馏水中，过滤，上清液上于D101大孔树脂柱中，依次用蒸馏水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇和90％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱1.9‑2.1L溶剂，流速2.5‑3.5mL/min，分别回收每个梯度洗脱后的洗脱液，进行减压回收得到六个馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，筛选出其中菌落直径最小对应的馏分A；所述D101大孔树脂柱的直径为3.0‑5.0cm，大孔树脂柱长度为23‑27cm；S4：C18中压色谱分离：取S3的A馏分经C18中压色谱(MPLC)分离，甲醇:水梯度洗脱，依次用5％甲醇、15％甲醇、25％甲醇、35％甲醇和50％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱0.8‑1.2L溶剂，流速2.5‑3.5mL/min，各梯度洗脱后的洗脱液经HPLC检测，筛选合并相同馏分，形成不同梯度的B类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同B类馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，筛选菌落直径最小B类馏分中的一种，定义为B1馏分；S5：葡聚糖凝胶LH‑20柱层析：将S4中B1馏分经SephadexLH‑20凝胶柱层析分离，依次用5％甲醇、15％甲醇、25％甲和35％甲醇洗脱，每个梯度洗脱0.9‑1.1L溶剂，流速2.5‑3.5mL/min，HPLC检测合并相同馏分，形成不同梯度的C类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同C类馏分的PDA培养基中，置于23‑33摄氏度的恒温培养箱培养3‑5d，筛选菌落直径最小的馏分，定义为C1馏分；S6：半制备液相分离：S5所得C1馏分经半制备液相分离，依次用18％甲醇、27|％甲醇、36％甲和45％甲醇洗脱，每个梯度洗脱0.9‑1.1L溶剂，流速2.5‑3.5mL/min，HPLC检测合并相同馏分，形成不同梯度的D类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同D类馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，菌落直径最小的馏分为茼蒿抑菌活性单体。...

【技术特征摘要】
1.一种茼蒿抑菌活性单体，其特征是包括以下步骤：S1：茼蒿茎叶预处理：称取新鲜的茼蒿茎叶20Kg，自然晾干后，于45-55℃鼓风干燥机中干燥10-14h，精确称取1.7-2.3Kg干燥后的茼蒿，于中药材粉碎机中粉碎，过40目筛；S2：浸提：加入48-52L的95％乙醇超声波辅助提取2-4次，每次1-3h，合并滤液减压浓缩，得到浸膏；S3：大孔树脂柱层析：浸膏溶解于1.1-1.3L蒸馏水中，过滤，上清液上于D101大孔树脂柱中，依次用蒸馏水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇和90％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱1.9-2.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，分别回收每个梯度洗脱后的洗脱液，进行减压回收得到六个馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，筛选出其中菌落直径最小对应的馏分A；所述D101大孔树脂柱的直径为3.0-5.0cm，大孔树脂柱长度为23-27cm；S4：C18中压色谱分离：取S3的A馏分经C18中压色谱(MPLC)分离，甲醇:水梯度洗脱，依次用5％甲醇、15％甲醇、25％甲醇、35％甲醇和50％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱0.8-1.2L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，各梯度洗脱后的洗脱液经HPLC检测，筛选合并相同馏分，形成不同梯度的B类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同B类馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，筛选菌落直径最小B类馏分中的一种，定义为B1馏分；S5：葡聚糖凝胶LH-20柱层析：将S4中B1馏分经SephadexLH-20凝胶柱层析分离，依次用5％甲醇、15％甲醇、25％甲和35％甲醇洗脱，每个梯度洗脱0.9-1.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，HPLC检测合并相同馏分，形成不同梯度的C类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同C类馏分的PDA培养基中，置于23-33摄氏度的恒温培养箱培养3-5d，筛选菌落直径最小的馏分，定义为C1馏分；S6：半制备液...

【专利技术属性】
技术研发人员：范淑英，张新龙，李珊珊，刘琳，刘琼，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西,36