一种癌症基因及其医药用途制造技术

本发明专利技术公开了一种癌症基因及其医药用途。本发明专利技术人命名该基因为ＰＰＯ基因，其ｃＤＮＡ核苷酸序列如ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．１所述。其ＤＮＡ长度约３６－ｋｂ，ｃＤＮＡ长度６０２２碱基。ＰＰＯ的氨基酸序列具有编码ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ．２所示的９９３个氨基酸残基的可读框的基因。该基因在人类多种癌组织中（卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，脑癌，胃癌，肝癌，子宫癌等）都有过表达。活性成份可制备成癌症诊断剂或试剂盒。其表达产物的抗体为活性以及其反义核苷酸转移载体或用其反义核苷酸转化／转染的细胞系作为活性成分可制备成药学制剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新基因及其用途，具体地说是人体1号染色体短臂36区(1p36)的新基因及其医药用途。
技术介绍
现代生物学研究表明，癌的发生是一种多因子多步骤的复杂事件，是多种癌基因激活或抑癌基因失活的结果。目前，癌基因医学研究主要包括三个方面(1)寻找具有治疗意义的目的基因。(2)建立有效的向靶细胞转移目的基因的载体系统。(3)使目的基因在靶细胞中表达，发挥生物学效应。因此，寻找癌基因或抑癌基因是目前癌症研究中的重中之重。人体1p36的杂合性缺失和染色体获得已有报道(reviewed by Schwab et al.1996 Kraggerud et al.，2000；Loveday et al.，2000；Stock et al.，2000；Alvarez et al.，2001；Zielenska et al.，2001)。这些研究结果提示，在此区存在癌基因或抑癌基因。
技术实现思路
本专利技术的目的就是筛选并分离出1p36.13区域中出现的新的与癌相关的基因及转录物，并开发其具有的医药用途。本专利技术的目的是这样实现的本专利技术人利用克隆筛选技术，在人类(homo sapiens)第1号染色体上，找到了一个新的癌基因。该基因在人类多种癌组织中(卵巢癌，乳腺癌，胰腺癌，结肠癌，肺癌，前列腺癌，脑癌，胃癌，肝癌，子宫癌等)都有过表达，PCR定量显示，其高出正常组织数百至数千倍。进一步研究证实，该基因与增殖及磷酸化有关。将该基因导入细胞接种于裸鼠皮下，经过一个月的观察，可长出肿瘤。另外，该基因与非常著名的MAPK经路有关。其能够刺激RAS过表达和MEK，ERK2磷酸化。用干扰RNA(RNAi)的方式，阻断该基因的表达，可以减少磷酸化和PCNA的表达。在细胞水平和活体均已证实能够抑制癌细胞的生长。本专利技术人命名该基因为PPO基因(Phosphorylation and ProliferationOncogene)。由PPO的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。其DNA长度约36-kb，cDNA长度6022碱基。PPO的cDNA核苷酸序列(SEQ ID NO.1)推断的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。其具有编码SEQ ID NO.2所示的993个氨基酸残基的可读框的基因。本专利技术的PPO基因编码的氨基酸分子量为100kD。该核苷酸序列的编码区代表密码子的组合的例子，所述密码子针对SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中的各自氨基酸残基。本专利技术基因中密码子的组合不限于SEQ ID NO1中所示的例子。密码子的任意组合可用于各自的氨基酸残基。密码子的选择可以采用常规方式进行。本专利技术基因的生产方法是从其中表达本专利技术基因的适当来源中以常规程序制备cDNA文库或直接购得，并且使用适当的探针或特异于本专利技术基因的抗体从该文库中筛选所需的克隆。适用作cDNA来源的是例如表达本专利技术基因的各种细胞和组织以及从中衍生的培养细胞。来自这种来源的总RNA的分离，mRNA的分离和纯化以及cDNA的获取和克隆可以按常规方式进行。市售的cDNA文库如购于Clontech(PaloAltocA)公司的各种cDNA文库可用于本专利技术基因的生产。从cDNA文库生产的本专利技术基因，其筛选方法没有特别的限制，可采用常规的方法。筛选方法的例子，包括使用针对由cDNA所产生的蛋白的特异抗体来筛选相应cDNA克隆免疫筛选方法，使用探针选择性地与目的DNA序列结合的方法，如噬菌斑杂交方法或菌落杂交方法，以及这些方法的组合。作用于上述方法的探针，一般可使用依据本专利技术基因的核苷酸序列的信息而化学合成的DNA。已获得的本专利技术基因或其片段也可用于探针。依据本专利技术基因的核苷酸序列的信息而设计的有义引物和反义引物可用作筛选的探针。在获得本专利技术基因中，可通过PCR的DNA/RNA扩增。特别是可采用RNACE方法获得全长的cDNA。用于这些PCR方法中的引物可参考本专利技术基因的核苷酸序列信息进行合理设计，也可通过常规程序合成。本专利技术基因可通过常规程序进行检测，如PCR方法。当选择PCR方法用于检测时，有待使用的引物可以是仅能导致本专利技术基因选择性扩增的任何引物。本专利技术PPO基因的筛选、分离、确定、克隆、核苷酸序列的确定是按下列方法进行的。cDNA文库筛选胎肝，胎脑，胰腺和肾脏cDNA文库购于Clontech(Palo Alto，CA)。大肠，肺，肝，卵巢和纤维母细胞的cDNA文库购于Stratagene.(La Jolla，CA)。设计10组引物，用来筛选cDNA文库，通过cDNA文库筛选，最终确定EST Hs.154797并克隆全长cDNA。精确定位PPO于1p36.13并测定DNA序列用自己所做的1p36叠连群(contig)，通过DNA印迹杂交(SouthernBlotting)杂交的方式找到BAC克隆b203I24，b140B13，b81G11，and b57B11，精确定位于1p36.13并测定DNA序列。指出外显子序列利用GenScan program(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)(Burge andKarlin，1997)指出外显子及内含子序列。利用RACE方法找到5’端的序列。利用5’SMART RACE试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)，自肾癌细胞株ACHN找到5’端的序列。引物如下R1，5’-AACCAACTTCTTGGATCCAGGGGA-3’. R2，5’-TTGGAATTCAATCAAACTTGCCCACCTG-3. 细胞培养OVK18，OVK18#102(Uehara et al.，1984)，OVCAR3(Hamilton et al.，1984)，CoLoTC(Quinn et al.，1979)，Lu65(Hirohashi et al.，1989)，HT1(Tsuchiya et al.，1982)，HCT15(Dexter et al.，1979)，HEC1A(Kuramotoet al.，1972)，ACHN(Giard et al.，1973)，U251N(Hirohashi et al.，1978)，SUN5(Brattain et al.，1981)，LK-2(Yoshioka et al.，1989)和NIH/3T3(Aaronson SA et al)PK1，PK8 and PK9，(Kobari et al.，1986)，所用细胞均来自东北大学加龄医学研究所。LNCaP(Gibas et al.，1983)，HEK 293(Graham et al.，1977)and U87(Beckma.et al.，1971)购于美国ATCC(Manassas，VA).并严格按照说明培养。反转录PCRRNA自冷冻组织或细胞株中提取。通过翻转录变成cDNA后，PCR条件如下94℃ 5分，94℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，40个循环。72℃ 7分。引物如下F，5’-TTTGATTGGAGACAGCAATATG-3’。R，5’-CTGCGATGTACCTTACAGAC-3’。定量反转录PCR定量PCR机器用ABI PRISM 7000 Sequence Det本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人体基因，位于１ｐ３６．１３区，其ｃＤＮＡ核苷酸序列如ＳＥＱＩＤＮＯ．１所述。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘思源，张玉想，
申请(专利权)人：刘思源，张玉想，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]