控制培养的方法及其设备技术

一种控制培养方法，其中细胞好氧培养生产代谢物，其特征在于，向培养汁中加入底物和（或）诱导物，用以细胞所放出的二氧化碳量为基础的第一参数对以细胞所耗氧气量为基础的第二参数之比率的变化为指导，判定细胞生长的终点和（或）代谢物的产量或终止培养．其中的比率例如是呼吸商．Ｃ１２Ｒ１：４６）（*该技术在2006年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及控制培养的方法及其设备。更具体地讲，是涉及控制培养由微生物，动物细胞或植物细胞有效地生产如抗生素，氨基酸，酶和生理活性物质这类代谢物的方法及其设备。用微生物，动物细胞或植物细胞生产上述的代谢物是常规的作法。大多数已经采用的常规方法，是在培养罐中的培养基上对种子培养物进行简单的培养，其生产力不高。因此，本专利技术者们已经对把底物和诱导物加入到培养过程中并从而改善生产力的培养方法进行了研究。迄今还没有报导过应该将底物和诱导物加入到培养阶段的工业性研究。例如，日本公开待批专利第141796/1983已经公开了一种生产代谢物，即肽的培养方法。然而，在这一方法中却不可能观察到细胞的连续生长，即在线生长。那么事实上当然也就没有讨论加入底物和(或)相似物质的适宜时机。日本公开待批专利第125686/1977揭示了一种培养酵母的方法，虽然它不是用来生产代谢物。这一方法包括根据总耗氧率并同时使被称作为呼吸商的指数保持在限定范围内的情况来将肉汤加到培养物中。但是，其中并没有采用包括加入底物和(或)类似物并监测呼吸商变化的过程。本专利技术的目的是提供一种有效地培养细胞以工业规模生产代谢物的方法和其设备。在本专利技术的方法中，是在好氧条件下培养细胞生产代谢物，其特征在于，向培养液中加中底物和(或)诱导物，确定细胞生长的终点和(或)代谢物的生产，或者根据建立在细胞培养物放出的二氧化碳量之上的第一参数相对于建立在细胞培养物耗氧量之上的第二参数的变化率来终止培养。本专利技术中所用的细胞，可以是微生物细胞，动物细胞或植物细胞。把本专利技术应用于培养基因重组的细菌细胞时，将会产生特别显著的效应。在本专利技术的方法中，代谢物的生产可在细胞培养之后，或在细胞培养的同时进行。从工业观点出发，则优选后一种方法。对每一个参数的测定及对培养的控制，包括根据参数来开始或停止控制，最好以在线方式进行。以这样的参数为基础的一个典型的比率是呼吸商，此后简称为RQ。RQ指的是二氧化碳量与氧气量之比，并由下列各式所代表。即RQ可由下列各式确定，其中△O2表示输入气与排出气之间氧气量的改变，相似地，△CO2代表输入气与排出气之间二氧化碳量的改变，Q代表总的气体量，Cell代表细胞数量。RQ＝△CO2/△O2(1)RQ＝Q·△CO2/Q·△O2(2)RQ＝(△CO2/Cell)/(△O2/Cell) (3)△O2和△CO2在各式中，是基于上述数据的参数。在预先知道输入气中各成份浓度的情况下，则只需测定排出气中各成份的浓度。进而，这一比率不受RQ的限制，但能被下述方式所修饰。例如这样的一些比率，RQ-1，RQ×A，此处A代表一个常数，RQ÷B，此处B代表一个常数，△CO2/(△CO2+△O2)，△O2/(△O2+△CO2)，(△CO2×B)/(△O2×A)和(△CO2+A)/(△O2+B)，它们均可用于本专利技术。优选的加入底物和(或)诱导物的时机，是在以RQ为指导，从RQ开始上升至这一上升刚好终止的期间内。RQ的第二个峰，一般被认为是判定代谢物生产终止的尺度，因此，优选在这一点终止培养。本专利技术的设备包括培养罐;在培养罐上有开口的输气管;排气管;底物输入管;测定输气管中通过气量的第一块气量表;第一个氧气分析仪;测定由培养罐上方经过排出管气量的第二块气量表;第二个氧气分析仪;二氧化碳分析仪，以及计算机，用作输入从每个表和分析仪来的信号，以及用于输出开启或关闭从底物输入管到培养罐的管道和(或)送料控制器的信号。应该理解的是，在不脱离本专利技术的范围之内，可以将一些除上述以外的仪器加到本专利技术的设备上，例如，将二氧化碳分析仪安装在供气管上并装有第一个氧气分析仪，或者一个罐用于加入底物而另一个罐用于加入诱导物。在这种情况下，二氧化碳分析仪输出的信号应当与其他仪表和分析仪的输出信号一同传送到电子计算机。另一方面，当输入气的组分，即氧气和二氧化碳的浓度已预先知道了的话，例如，使用了氧气钢瓶，则这些用于输入气的气体分析仪就可被免去，因而就没必要将这些分析仪的信号输入到计算机中。这种情况也包括在本专利技术的范围内。进而，从在线操作的观点来看，优选根据上述计算机的输出来加入底物和诱导物。在这种情况下，优选的加入这些物质的方式，是通过泵和(或)装在每个罐上的阀门，或装在从每个罐连到培养罐的管道上的阀门。附图的简要说明图1是表示复合质粒pTREZ1结构的示意图。图2表示trp启动子下游方的碱基序列。图3表示构造复合质粒pTREZ1的流程图。图4表示RQ，细胞生长和β-半乳糖苷酶生产相互之间的关系。图5是本专利技术培养控制设备实例的示意图。图6和图7分别各自表示在体积为50升的自动控制培养罐中SM发酵试验的结果。图8和图9表示与本专利技术实施例相关的实际控制培养的结果。作为本专利技术的第一个实例，以下描述的是培养基因重组细菌生产β-半乳糖苷酶(β-gal)的方法。近来已发展出了这样的基因重组技术，即将带有关于生产有用物质遗传信息的基因整合到宿主微生物的载体质粒上从而制备出复合质粒，从而利用保留有这种复合载体的宿主微生物大量生产有用的物质。这些技术已被实际用于生产干扰素，胰岛素及类似物质，其中以大肠杆菌(Escherichia coli)作为宿主微生物。然而，迄今还没有已知的用带有所需基因的基因重组细菌工业化大量生产所需产物的方法，所以，一直急需建立一种高效培养基因重组细菌的方法。在本实例中，微生物细胞内载有或保留有包括所需基因及载体和启动子的复合质粒，并且将这种能诱导基因表达的细胞进行培养，使微生物表达所需的基因并大量收集产物，在RQ在培养期间表现迅速上升时，同时加入底物和诱导物。作为表达所需基因的启动子，可用的有trp(色氨酸)启动子，lac启动子(Nature，281，pp544-548，1979)，tac启动子(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80，pp21-25，1983)等等。作为由trp启动子和β-半乳糖苷酶基因连接而获得的复合质粒，可用的有具备图1所示结构的质粒pTREZ1。复合质粒pTREZ1可由质粒pTRE1和pMC1403获得。含有trp启动子的复合质粒pTRE1，是将含有大肠杆菌的trp操纵子，trpL(引导肽)和trpE(邻氨基苯甲酸合成酶)的部分终端的约500bp(碱基对)的DNA片段插入到质粒pBR322(Gene，29，pp41-49，1984)的EcoRⅠ位点而获得的。trp启动子的方向是质粒pBR322的Trc(四环素抗性基因)的方向。trp启动子上游方的EcoRⅠ位点，需要充满DNA聚合酶Ⅰ，以便仅改变启动子下游方的EcoRⅠ位点。图2表示了下游区的trp启动子的碱基序列。将外来基因连接在trpE多肽基因的EcoRⅠ位点上，就能以与trpE多肽N末端的8个氨基酸相融合的形式表达外来基因。另一方面，对β-半乳糖苷酶基因，可以使用质粒pMC403(J.Bacteriol，143，pp971-980，1980)。质粒pMC1403是将6.2Kb(千碱基对)的β-半乳糖苷酶基因(lac′Z+lacY)插入到pBR322的EcoRⅠ位点和SalⅠ位点之间而获得的。图3表示了建造质粒pTREZ1的过程，其中，β-半乳糖苷酶基因连在trp启动子的下游方。具有10.21K本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种控制培养方法，其中在好氧条件下培养细胞生产代谢物，其特征步骤在于：以细胞放出的二氧化碳量为基础确定第一个参数；以细胞的耗氧量为基础测定第二个参数；计算第一参数与第二参数的比率；并且在所述比率之改变的指导下控制培养，所述的 控制培养步骤包括，至少向培养汁中加入一次底物的步骤，判定细胞生长的终点，终止培养，判定代谢物生产的终点，对加入底物以及停止培养进行控制。

【技术特征摘要】
JP 1985-3-25 58480/851.一种控制培养方法，其中在好氧条件下培养细胞生产代谢物，其特征步骤在于以细胞放出的二氧化碳量为基础确定第一个参数；以细胞的耗氧量为基础测定第二个参数；计算第一参数与第二参数的比率；并且在所述比率之改变的指导下控制培养，所述的控制培养步骤包括，至少向培养汁中加入一次底物的步骤，判定细胞生长的终点，终止培养，判定代谢物生产的终点，对加入底物以及停止培养进行控制。2.根据权利要求1所述的控制培养方法，其中所说的比率是呼吸商。3.根据权利要求1所述的控制培养方法，其中所述的细胞是微生物细胞。4.根据权利要求2所述的控制培养方法，其中在所述加入底物的步骤中，将诱导物与所述的底物一同加入到所述的培养汁中。5.根据权利要求2所述的控制培养方法，其中，在所述的加入底物的步骤中，是在所述呼吸商开始上升直至下降的期间内加入底物。6.根据权利要求4所述的控制培养方法，其中所述的底物和诱导物是在所述呼吸商开始上升直至下降的期间内加入。7.根据权利要求1所述的控制培养方法，其中所述的控制培养步骤包括，将诱导物与底物一同加入到培养汁中的步骤，以及判定细胞生长的终点。8.根据权利要求2所述的控制培养方法，其中所述的控制培养步骤包括，在所述呼吸商开始上升直至上升刚刚结束的期间内，将一种底物和诱导物加入到培养汁中，以及确定细胞生长的终点。9.根据权利要求2所述的控制培养方法，其中所述的控制培养步骤包括，将诱导物与所述的底物一同加入到培养汁中的步骤，以及控制培养的终止。10.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：清水范夫，福真一，西村信子，绪田原蓉二，住谷知明，
申请(专利权)人：株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]