用于预防和治疗肝硬化的组合物和方法技术

本发明专利技术提供了治疗受试者中的肝硬化的方法，包括给受试者施用治疗有效量的ｒＡＡＶ／ＣＡＧ－ＳＴＡＰ载体，以治疗受试者中的肝硬化。本发明专利技术还提供了预防处于肝硬化危险中的受试者的肝硬化的方法，包括给受试者施用预防有效量的ｒＡＡＶ／ＣＡＧ－ＳＴＡＰ载体，以预防受试者中的肝硬化。最后，本发明专利技术提供了有关的病毒载体和药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2003年5月28日提交的美国临时申请号60/473,992的优先权，其内容在这里引入本申请作为参考。在本申请中，用括弧中的作者名和日期参考各种出版物。这些出版物的完整引用参见权利要求之前的说明书末尾部分。为了更充分地描述到本文所述的和要求保护的专利技术的日期为止技术人员已知的技术的状况，将这些出版物的公开内容整体引入本申请中作为参考。
技术介绍
肝硬化是一种世界范围的健康问题。它是纤维瘢痕形成的不可逆的最终结果，且其特征在于再生小结和纤维变性组织的正常肝结构的弥散性结构破坏(Lee，1997)。它已经成为病死的主要原因之一。肝硬化是由慢性肝损伤产生的疾病。损伤可能是中毒性的(长期醇摄入)、感染性的(病毒性肝炎，主要由乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒造成)、免疫学的(原发性胆汁性肝硬变)、通过胆道阻塞(继发性胆汁性肝硬变)、代谢的(Wilson氏病)。所有形式的肝硬化具有共同特征胞外基质(ECM)蛋白的合成和过度沉积，主要是胶原I和更小程度的胶原IV和III，和随后的肝细胞小结的形成、异常的血管形成和门静脉高血压。这些病理生理学过程导致血液供给的变化，且结果造成肝细胞营养的变化。不管病原和形态学差异如何，所有形式的肝硬化都具有共同的结果，即造成患者死亡的肝衰竭。由于广泛发生的慢性肝炎和明显缺乏肝纤维化的确定疗法，导致了肝硬化发生率的提高。据估计，世界范围内有3.5亿人患有慢性HBV感染(Xu等，2003b；Ueki等，1999)。在东南亚、非洲和中国，超过50％的人口受到感染，且8％至15％已经变成慢性感染。在这些地区，慢性HBV感染是最高达50％肝硬化病例的原因(Xu等，2003b；Ueki等，1999)。产生的肝结构畸变会破坏肝细胞的功能，从而造成威胁生命的全身并发症。常规疗法仍然不可治疗肝硬化。载体开发的最近进展已经预兆了一种可能的治疗(Lee，1997；Rudolph等，2000)。但是，治疗性基因(例如肝生长因子(HGF)(Ueki等，1999)和端粒酶基因(Rudolf等，2000))的致癌潜力可能阻止它们在人类中的应用。合适的用于临床实验的治疗性基因的可用性，会极大地促进肝硬化的新疗法的开发。最近，从纤维变性的肝和星状细胞中分离出了新的内源的过氧化物酶基因、星状细胞活化-相关蛋白(STAP)。已经指出了STAP在异化过氧化氢和脂质氢过氧化物方面的潜力(Kawada等，2001)。由于已经报道二者都能触发HSC活化，且可以随后促进肝纤维化的发展，所以肝星状细胞(HSC)的活化是肝硬化发展的一个关键步骤。认为在HSC的活化过程中，氧化应激在转录因子的活化中起重要作用。下面的实验细节描述了STAP如何在肝硬化的发展过程中作为抗纤维变性的过氧化物清除剂起作用，并证实了STAP作为用于预防或逆转恶化的纤维化的治疗性基因的潜力，所述的纤维化是硬化的肝的最明显的标志。在该研究中，体内和原代培养方法互补地用于鉴别星状细胞活化的调节机理。结果提供了肝硬化的新的替代治疗方法。已经从许多物种(包括灵长类动物)中分离出了腺伴随病毒(AAV)。它们属于小DNA病毒科，且具有单链DNA基因组。关于它的复制生活周期，AAV需要辅助病毒(例如腺病毒)的存在来进行复制。在没有辅助病毒的情况下，AAV会整合进宿主基因组中，并保持潜伏。当潜伏地感染的细胞遇到辅助病毒的感染时，整合的AAV基因组会自救，并经历生产性的裂解周期。近年来，几项研究已经证实了rAAV基因送递系统在治疗多种人和动物疾病中的功效。AAV具有几项特征，它们使其特别适用于基因治疗。它是缺陷型的、辅助依赖性的病毒，且野生型的AAV在人和其它物种中是不致病的。可以生产完全没有辅助病毒的载体。去除了整个编码序列的重组AAV载体仅仅剩下145-个碱基对的末端重复序列。因此，这些载体缺乏所有的病毒基因，使重组和病毒基因表达的可能性最小化。尽管AAV可以诱导免疫学反应，但与伴随早代腺病毒载体的炎症相比，它们是相对温和的。AAV载体的主要优点包括稳定的整合、低免疫原性、长期表达和感染分裂的和未分裂的细胞的能力；主要限制包括AAV在不同的细胞类型中的感染性的差异和可以包装的重组基因组的大小。但是，以前的研究已经证实，AAV在肝基因治疗中可以是有效的。更具体地，Xu等已经显示，通过肝门静脉注射施用的AVV颗粒可以在肝中产生高拷贝数和转基因的稳定表达(Xu等，2001)。至今尚未开发出有效的肝硬化治疗。需要将最佳启动子和基因送递系统与适当的治疗性基因相组合，来开发非常有效的治疗性的和安全的基因送递系统，以治疗肝纤维发生、预防慢性炎症和预防硬变组织的积累。下面公开的实验细节提供了预防和治疗肝硬化的新方法。专利技术概述本专利技术提供了治疗受试者中的肝硬化的方法，包括给受试者施用治疗有效量的rAAV/CAG-STAP载体，以治疗受试者中的肝硬化。本专利技术还提供了预防或延迟处于肝硬化危险中的受试者的肝硬化发展的方法，包括给受试者施用预防有效量的rAAV/CAG-STAP载体，以预防或延迟发展。本专利技术还提供了治疗患有肝硬化的受试者中的肝硬化的方法，包括给受试者施用治疗有效量的能编码星状细胞活化-相关蛋白(STAP)的基因，以治疗受试者中的肝硬化。本专利技术还提供了预防或延迟处于肝硬化危险中的受试者的肝硬化发展的方法，包括给受试者施用预防有效量的能编码星状细胞活化-相关蛋白(STAP)的基因，以预防或延迟受试者中的肝硬化。本专利技术还提供了第一种病毒载体，其包含rAAV/CAG-大鼠STAP载体(CCTCC专利保藏号V200306)。本专利技术还提供了一种试剂盒，其包含本专利技术的第一种病毒载体和使用说明书。本专利技术还提供了第二种病毒载体，其包含rAAV/CAG-人STAP载体(CCTCC专利保藏号V200305)。本专利技术还提供了一种试剂盒，其包含本专利技术的第二种病毒载体和使用说明书。本专利技术还提供了第一种药物组合物，其包含本专利技术的第一种病毒载体和药学上可接受的载体。本专利技术还提供了第二种药物组合物，其包含本专利技术的第二种病毒载体和药学上可接受的载体。最后，本专利技术提供了治疗受试者中的肝硬化的方法，包括给受试者施用治疗有效量的包含抗氧化剂基因的病毒载体，以治疗受试者中的肝硬化。附图简述附图说明图1A-1H图1A和1B.rAAV/CAG-STAP载体图(A)rAAV/CAG-大鼠STAP(CCTCC专利保藏号V200306)和(B)rAAV/CAG-人STAP(CCTCC专利保藏号V200305)。图1C和1D.由DIG免疫检测试剂盒测得的肝切片的原位杂交(1C)未转导的大鼠和(1D)用rAAV/CAG-大鼠STAP转导了1个月的大鼠。图1E-1H.肝切片的免疫组织化学染色，所述切片来自(1E)用rAAV/CAG-EGFP转导的大鼠，(1F)未转导的大鼠(即，用PBS处理的大鼠)，(1G)用rAAV/CAG-大鼠STAP转导的大鼠，和(1H)用rAAV/CAG-人STAP转导10周的大鼠。图2A-2F(图A和B)未转导的大鼠和未用CCl4处理的肝，(图C和D)未转导的和CCl4处理的(8周)大鼠的肝，(图E和F)用rAAV/CAG-大鼠STAP转导2周、然后用CCl4处理8周的大鼠的肝。图3A-3J图3A-3D.本文档来自技高网...

【技术保护点】
治疗受试者中的肝硬化的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的ｒＡＡＶ／ＣＡＧ－ＳＴＡＰ载体，以治疗受试者中的肝硬化。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：许瑞安，李欣燕，冯戬云，
申请(专利权)人：香港大学，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]