一种定向突变的基因工程巴曲酶及用途制造技术

一种定向突变的基因工程巴曲酶，能使含抗凝剂的动物血浆凝固，其特征在于所述定向突变的基因工程巴曲酶氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列的Ｃ－末端删除了十个氨基酸，同时第１３３位的Ｔｙｒ突变为Ｇｌｕ。本发明专利技术能够通过以分泌表达的方式大量生产获得，同时具有较高的生物活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因重组方法制备定向突变的巴曲酶——Batroxobin。其关键是巴曲酶基因的定向改造、合成、克隆、表达及产物的发酵表达和分离纯化制备。突变的巴曲酶既可以作为止血药的主要成份，也可以直接用作止血药物。
技术介绍
自1963年奥地利学者Von Klobusitzky首次从巴西矛头蝮蛇(Bothropsatrox)毒液中分离得到一种丝氨酸蛋白水解酶(类凝血酶)，也就是所说的巴曲酶。至今已发现30多种蛇毒中含有类凝血酶组份，并有20多种先后得到分离和纯化，它们都能作用于哺乳动物血浆中纤维蛋白原A链中的Arg16-Gly17间的肽键，释放出纤维蛋白肽A，从而快速地将血液中的纤维蛋原转变为纤维蛋白，这些纤维蛋白就能聚集成疏松的栓子来封闭伤口，实现快速止血的效果。同时，在体内它并不激活凝血因子XIII，由其水解产生的纤维蛋白凝块的侧链不能交联，易被纤维蛋白溶酶降解，所以不会造成血液系统的栓塞。巴曲酶现已经被成功地开发成止血药——进口的有立止血(Reptilase)，国产的有巴曲亭，在临床上具有很好的止血效果。成熟的巴曲酶分子是由231个氨基酸残基组成的单链蛋白，其氨基酸序列如下1VIGGDECDIN EHPFLAFMYY SPRYFCGMTL INQEWVLTAA51 HCNRRFMRIH LGKHAGSVAN YDEVVRYPKE KFICPNKKKN81 VITDKDIMLI RLDIPVKNSE HIAPLSTPSN PPSVGSVCRI 121 MGWGAITTSE DT PDVPHCA NINLFNNTVC REAYNGLPAK161 TLCAGVLQGG IDTCGGDSGG PLICNGQFQG ILSWGSDPCA201 EPRKPAFYTK VFDYLPWIQS 其DNA序列如下1 GTCATTGGAG GTGATGAATG TGACATAAAT GAACATCCTT TCCTTGCATT51 CATGTACTAC TCTCCCCGGT ATTTCTGTGG TATGACTTTG ATCAACCAGG101 AATGGGTGCT GACCGCTGCA CACTGTAACA GGAGATTTAT GCGCATACAC151 CTTGGTAAAC ATGCCGGAAG TGTAGCAAAT TATGATGAGG TGGTAAGATA201 CCCAAAGGAG AAGTTCATTT GTCCCAATAA GAAAAAAAAT GTCATAACGG251 ACAAGGACAT TATGTTGATC AGGCTGGACA GACCTGTCAA AAACAGTGAA301 CACATCGCGC CTCTCAGCTT GCCTTCCAAC CCTCCCAGTG TGGGCTCAGT351 TTGCCGTATT ATGGGATGGG GCGCAATCAC GACACTATC GATACGTATC401 CCGATGTCCC TCATTGTGCT AACATTAACC TGTTCAATAA TACGGTGTGT451 CGTGAAGCTT ACAATGGGTT GCCGGCGAAA ACATTGTGTG CAGGTGTCCT501 GCAAGGAGGC ATAGATACAT GTGGGGGTGA CTCTGGGGGA CCCCTCATCT551 GTAATGGACA ATTCCAGGGC ATTTTATCTT GGGGAAGTGA TCCCTGTGCC601 GAACCGCGTA AGCCTGCCTT CTACACCAAG GTCTTTGATT ATCTTCCCTG651 GATCCAGAGC ATTATTGCAG GAAATAAAAC TGCGACTTGC CCG理论计算出其分子量为25.5KD，等电点为7.39，国外从Bothrops atrox毒液中提取的巴曲酶，其实际分子量为42KD，这种分子量的偏差是由于糖基化修饰的缘故。从巴曲酶蛋白质一级结构中可以发现，其分子内有两个N-糖基化位点Asn146-Asn147-Thr148和Asn225-Lys226-Thr228。此外，Bothropsatrox的其他亚种以及其他种类毒蛇的毒液中也能提取到具有巴曲酶活性的蛋白，不过其分子量从29.1KD到42KD不等，这可能是由于不同亚种之间氨基酸组成上差别或糖基化的程度不同所引起的。巴曲酶分子中有12个半胱氨酸，根据已知的丝氨酸蛋白酶类分子的研究结果，推测这12个半胱氨酸可能有Cys7-Cys139、Cys26-Cys42、Cys74-Cys230、Cys118-Cys184、Cys150-Cys168、Cys174-Cys199六个分子内二硫键的形成(Itoh n.et al.The J.of BiologicalChemistry，262，3132，1987)。考虑到从巴西进口蛇毒原料成本较高，同时，巴西矛头蝮蛇也是稀有的保护蛇种，蛇毒产量也有限，因此，我们设想采用基因工程的方法大量生产重组巴曲酶，以满足研究和临床应用的需要。巴曲酶蛋白虽然只有一条肽链，但是由于分子内二硫键多，还有糖基化修饰等，所以采用基因工程手段生产这种蛋白有很大的技术难度。这也应该是一直没有重组产品问世的主要原因之一。虽然研究者对天然巴曲酶的性质有比较多的了解，但是，对其分子生物学方面的研究一直进展缓慢，直到1987、1988年才由日本的研究者完成对巴曲酶基因的cDNA和基因组DNA测序工作(Nobuyuki Itoh etalJ.Biol.Chem.262(7)3132-3135，1987；J.Biol.Chem.，2637628-7631，1988)。Maeda M等采用基因重组方法，在E.coli中，采用融合表达系统，以包涵体(Inclusion Body)的形式表达出该成份，据报道得到了所谓有生物学活性巴曲酶(Maeda M.etal，J Biochem(Tokyo)，109(4)632-637，1991)，而且还为此申请了专利(Pat，No.JP2124092，1990)。但到目前为止，还没有重组巴曲酶用于动物试验和临床研究工作的相关研究报导。在E.coli中表达某些蛋白已经是较为常规的生产药用蛋白的基本手段，但是在对蛇毒类凝血酶实际研究中发现，在E.coli中表达蛇毒类凝血酶的量很少。潘华等采用RT-PCR法扩增出蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒类凝血酶基因Pallas，以表达载体pET-24a(+)构建T-7启动子控制下的表达质粒pET-Pallas，转化E.coli BL21(DE3)，并用0.4mmol/L IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹分析表明有生物活性的Pallas表达(潘华等，蝮蛇类凝血酶基因的分析及表达研究，生物化学与生物物理学报，1999，31，79)。Fan等采用PCR法扩增出蝮蛇(Agkistrodon acutus)的蛇毒类凝血酶基因Acutin，克隆到表达载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定向突变的基因工程巴曲酶，能使含抗凝剂的动物血浆凝固，其特征在于所述定向突变的基因工程巴曲酶氨基酸序列相对于天然的巴曲酶氨基酸序列的Ｃ－末端删除了十个氨基酸，同时第１３３位的Ｔｙｒ突变为Ｇｌｕ，具体为：１ＶＩＧＧＤＥＣＤＩＮ ＥＨＰＦＬＡＦＭＹＹＳＰＲＹＦＣＧＭＴＬＩＮＱＥＷＶＬＴＡＡ５１ＨＣＮＲＲＦＭＲＩＨＬＧＫＨＡＧＳＶＡＮＹＤＥＶＶＲＹＰＫＥＫＦＩＣＰＮＫＫＫＮ８１ＶＩＴＤＫＤＩＭＬＩＲＬＤＩＰＶＫＮＳＥ ＨＩＡＰＬＳＬＰＳＮＰＰＳＶＧＳＶＣＲＩ１２１ＭＧＷＧＡＩＴＴＳＥＤＴＰＤＶＰＨＣＡＮＩＮＬＦＮＮＴＶＣＲＥＡＹＮＧＬＰＡＫ１６１ＴＬＣＡＧＶＬＱＧＧＩＤＴＣＧＧＤＳＧＧＰＬＩＣＮＧＱＦＱ ＧＩＬＳＷＧＳＤＰＣＡ２０１ＥＰＲＫＰＡＦＹＴＫＶＦＤＹＬＰＷＩＱＳＩ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛百忠，薛雁，王宏英，徐梅，沈文彧，苏珊，
申请(专利权)人：沈阳守正生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]