一种抗单核细胞性白血病的抗体导向药物制造技术

本发明专利技术涉及一种抗单核细胞性白血病的抗体导向药，它是由骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合而成的杂交瘤细胞产生的ＩｇＧ１单克隆抗体，可特异性地与力达霉素结合，其Ｆｃ段可特异性与单核细胞表面的Ｆｃ受体结合，３Ｈ８抗体的联合应用可以降低力达霉素的使用剂量，并显著增加其抗单核细胞性白血病的效果，具有良好的临床应用前景，可望成为一种用于临床治疗单核细胞性白血病的新型靶向抗体药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于治疗单核细胞性白血病的新型抗体导向药物。
技术介绍
单核细胞性白血病是指主要以单核细胞增多为特征的白血病，包括急性粒—单核细胞白血病(M4)、急性单核细胞白血病(M5)、慢性粒—单核细胞白血病、慢性单核细胞白血病。由于单核细胞具有游走、吞噬的特点，故临床上浸润特征较为突出。这类白血病在临床上较常见，其恶性程度较高，易出现髓外浸润及凝血功能障碍，原发耐药者多，缺乏特异性药物，治疗较困难，早期死亡率高，诱导缓解率较低，且预后差。 针对单核细胞性白血病的特点以及目前治疗的缺陷，本专利技术制备了一种具有抗单核细胞性白血病作用的抗力达霉素抗体导向药物。 力达霉素(Lidamycin，LDM)是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的—株链霉菌(Streptomyces globisporus C-1027)产生的大分子肽类抗肿瘤抗生素，由110个氨基酸组成的辅基蛋白(MW10.5kDa)和烯二炔结构的发色团(MW843 Da)两部分组成。LDM对体外培养的癌细胞有强烈的杀伤作用，比丝裂霉素和阿霉素强10,000倍以上，动物体内实验表明，LDM对多种肿瘤有较好的疗效。 本专利技术提供的抗体药物3H8，是由杂交瘤细胞株3H8(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.1849)所分泌的单克隆抗体。该抗体为IgG1亚型，其可变区能与力达霉素特异性结合，其Fc段能与高表达Fc受体的单核细胞特异性结合。抗体3H8的Fc段与单核细胞的Fc受体结合后，可以介导细胞内吞作用，使3H8-力达霉素抗原抗体复合物进入单核细胞内，发挥靶向性杀伤单核细胞的作用。 基于以上所述，本专利技术进行了进一步探索，制备了抗力达霉素的单克隆抗体，与力达霉素联合应用，可以发挥靶向性抗单核细胞性白血病的作用。本专利技术所说抗单核细胞性白血病的抗体导向药物迄今尚未见有相关报道。
技术实现思路
本专利技术所说的单克隆抗体3H8，是用力达霉素免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选得到的稳定型杂交瘤细胞株3H8(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.1849)所产生的单克隆抗体，该细胞株为国内外首次报道。3H8抗体为IgG1亚型单克隆抗体，其可变区能与力达霉素特异性结合。3H8单克隆抗体的Fc段可与高表达Fc受体的单核细胞特异性结合。3H8抗体和力达霉素的免疫复合物与单核细胞的Fc受体结合后，在受体介导的内吞作用下，可使力达霉素进入单核细胞内发挥杀伤/诱导单核细胞凋亡的作用，从而显示靶向性抗单核细胞性白血病的功能。其作用机理如下所示 本专利技术的具体内容与实施步骤包括 抗力达霉素单克隆抗体细胞株3H8的构建； 抗力达霉素单克隆抗体3H8的制备； 抗力达霉素单克隆抗体3H8的鉴定； 3H8抗体与高表达Fc受体的人单核白血病细胞株U937细胞的结合实验； 力达霉素联用3H8抗体对U937细胞增殖的影响； 力达霉素联用3H8抗体对U937细胞凋亡的影响。 实验研究结果表明，杂交瘤细胞株3H8为稳定型高表达3H8单克隆抗体细胞株。 本专利技术所说3H8抗体的特征在于，其可特异性与力达霉素及其辅基蛋白结合，而对其它蛋白无交叉反应，具有较高的亲和力和特异性。 3H8抗体可与Fc受体高表达的细胞U937特异性结合，而不与Fc受体阴性的人宫颈癌Hela细胞结合。 LDM联合应用3H8抗体后，可降低LDM的给药剂量，对抑制U937细胞的增殖具有协同作用。LDM与3H8抗体联用对Fc受体阴性的Hela细胞无增效作用。 LDM联合应用3H8抗体，对诱导U937细胞凋亡有协同作用。LDM与3H8抗体联用，对诱导Fc受体阴性的Hela细胞凋亡无增效作用。 本专利技术的化合物(单克隆抗体)可用于制备抗单核细胞性白血病的新型抗体导向药物。 本专利技术的3H8细胞株高表达抗LDM单克隆抗体，可以采用无血清培养收集细胞上清以及小鼠腹水纯化制备单克隆抗体，并将其制成所需的剂型。 专利技术效果 本专利技术的优点与积极效果在于应用杂交瘤单克隆抗体技术制备了抗力达霉素的单克隆抗体3H8，它可通过其Fc段靶向性地与高表达Fc受体的单核细胞结合，其可变区能与力达霉素相结合，将力达霉素带到单核细胞周围，通过受体介导的内吞作用，使力达霉素进入单核细胞，靶向性地介导了LDM发挥抗单核细胞性白血病的作用。实验证明联合应用3H8抗体后，力达霉素对单核细胞性白血病U937细胞株的IC50可以降低13倍，且凋亡率显著增加。3H8抗体的联合应用可以降低力达霉素的使用剂量从而降低其副作用，并显著增加其抗肿瘤效果，具有良好的应用前景。 附图说明 图1-梯度稀释的3H8单抗与LDM亲和性曲线 其中X轴为抗体的对数梯度稀释度(lg)；Y轴为490nm的吸光度值 图2-3H8抗体非还原SDS-PAGE蛋白电泳 图3-3H8抗体与变性后LDM的结合(Western blot) 图4-3H8抗体检测LDM和LDP在HUVEC的定位实验(激光共聚焦扫描显微镜) 其中绿色荧光为LDM辅基蛋白的分布部位；蓝色荧光为Hoechst 33342复染细胞核 图5-3H8抗体检测LDM和LDP在HUVEC的定位实验(激光共聚焦扫描显微镜) 图6-3H8抗体检测LDM和LDP在Hep G2的定位实验(激光共聚焦扫描显微镜) 图7 3H8抗体与梯度稀释的LDM亲和性曲线 其中X轴为LDM的对数梯度稀释度(1gμM)；Y轴为490nm的吸光度值 图8 3H8抗体与Hela和U937细胞结合实验(荧光显微镜×300倍) 其中A 3H8抗体与Fc受体阴性的Hela未结合，无绿色荧光； B Hela细胞的细胞核被Hochest33342染色，呈蓝色荧光； C 3H8与U937细胞膜表面的Fc受体结合，呈绿色荧光； D U937细胞的细胞核被Hochest33342染色，呈蓝色荧光 图9力达霉素联合应用3H8抗体对U937细胞增殖的影响 X轴为LDM的对数剂量(lg M)，Y轴为相比空白对照组的存活细胞比例 图10力达霉素联合应用3H8抗体对Hela细胞增殖的影响 X轴为LDM的对数剂量(lg M)，Y轴为相比空白对照组的存活细胞比例 实施方案 以下实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。 <实施例1>.抗力达霉素单克隆细胞株3H8的制备 用紫外照射过的力达霉素作为免疫原免疫BALB/c小鼠，基础免疫共5次，间隔3周，每次抗原用量为50μg/只，初次用弗氏完全佐剂混合乳化，皮下多点注射，以后用弗氏不完全佐剂，腹腔注射，在融合前3天尾静脉注射，不加佐剂加强免疫，抗原用量100μg/只。取免疫小鼠的脾细胞与SP-2按常规方法进行融合，经HAT选择性培养基培养，用ELISA法筛选阳性克隆。采用有限稀释法，在96孔板中进行三次单克隆筛选，挑选强阳性的细胞3H8，培养条件DMEM高糖+10％胎牛血清(Gibco公司)，pH＝7.0左右，37℃，5％CO2培养箱培养 <实施例2>.抗力达霉素单克隆抗体3H8的制备 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单克隆抗体３Ｈ８，其特征在于所说抗体是由杂交瘤细胞株３Ｈ８（保藏编号ＣＧＭＣＣＮｏ．１８４９）稳定分泌的ＩｇＧ１型单克隆抗体，可特异性地与力达霉素相结合，其Ｆｃ段可与Ｆｃ受体相结合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳志钢，吴淑英，甄永苏，商悦，刘秀均，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]