用于递送双链RNA至有害生物的包含至少一个适配子的多结构域RNA分子制造技术

本发明专利技术涉及递送双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）至有害生物体的方法和构建体。更具体地，本发明专利技术涉及由包含以下的核苷酸序列组成的多结构域ＲＮＡ分子：（ｉ）至少一个适配子和（ｉｉ）至少一个形成双链ＲＮＡ的感兴趣核苷酸序列，所述双链ＲＮＡ包含退货的互补链，其中之一包含与有害生物靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。本发明专利技术还涉及编码所述多结构域ＲＮＡ分子的核酸，以及所述多结构域ＲＮＡ分子在农业中的各种应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般地涉及RNAi及其在基因沉默中的用途。而且，本专利技术还涉及用于递送双链RNA(dsRNA)至有害生物(pest)体的方法和构建体。
技术介绍
基因表达的靶向抑制是生物技术和基因工程中长期以来未能满足的需求。在过去的几年里，核酸化学和基因转移的进步已激发产生了设计特异性干扰基因表达的新方法。这些方法之一由作为用于控制基因表达的工具的双链RNA抑制(RNAi)组成，如WO 99/32619和WO 00/01846中所描述。双链RNA抑制基于将RNA导入活细胞以抑制靶基因在该细胞中的基因表达。所述RNA具有带双链结构的区域。双链RNA(dsRNA)具有以序列特异性方式使基因丧失功能的能力。当dsRNA被导入细胞时，其可激活靶向所述细胞质mRNA降解的机制，从而可在转录后水平上有效地沉默全部基因表达。已在许多不同来源真核生物(包括原生动物、真菌、植物、无脊椎动物和哺乳动物)的细胞类型中观察到RNAi。当长dsRNA一进入细胞，其就被具有RNA酶III样活性的酶(Dicer)切割成长度为21-25个碱基对的双链小干扰RNA(siRNA)。切割成siRNA是RNAi沉默机制中的早期步骤。双链RNA(dsRNA)的导入可在多种生物和细胞类型中引起基因特异性RNA干扰反应。在植物中，该技术可用于例如改变或提高植物对病原体和有害生物的抗性的目的。后种技术可包括当有害生物食用所述植物时，dsRNA被有害生物吸收。在通过摄食进行的递送中，dsRNA可以以营养物相同的方式被分配至来自摄食生物的肠的细胞。还可以想象位于“感染”细胞中的dsRNA可以经历细胞外排(cellular exit)和重新进入相邻“未感染”细胞的连续循环。然而，通过摄食递送dsRNA至有害生物是有限制的。涉及将dsRNA递送至摄食靶生物的困难很多，例如可包括需要使用非常高量的dsRNA以获得有效性。而且，dsRNA可容易地在植物中或在递送至靶生物体的过程中分解。此外，为了获得有效性，所述dsRNA分子应当被有害生物高效地吸收并递送至所述有害生物的正确靶部位。由于双链RNA抑制的出现，已经认识到对设计用于在有害生物中定点递送双链RNA的专门化构建体的需要。尽管存在各种可获得的用于直接或间接地将dsRNA导入细胞的方法，但很清楚这些方法效率通常很低，且具有实际的限制。因此，根据上述内容，存在对发展用于更高效地递送dsRNA至有害生物细胞以获得RNAi和杀死或麻痹所述有害生物的工具和方法的需要。本专利技术目标是提供用于在有害生物(包括线虫、昆虫和真菌)中递送双链RNA的改进方法和构建体。因此，本专利技术的一个目的是提供具有改进的性质以被高效地吸收入所述有害生物物种的细胞或组织内的dsRNA构建体。昆虫、真菌和线虫有害生物是对世界上商业重要的农作物造成损害的主要原因。针对减少农作物损失的当前策略主要依赖于化学杀虫剂。可替代地，具有内在有害生物抗性的转基因作物提供了很有前景的另一选择且正在继续开发。抗有害生物的植物可减少有害生物群体的生长、杀虫剂使用量和杀虫剂的环境影响。在本领域仍然存在对显示有害生物抗性的植物的巨大需要。因此，本专利技术的另一个目的是提供显示对有害生物如线虫、昆虫和真菌的抗性的抗有害生物植物。
技术实现思路
本专利技术提供了用于辅助将双链核糖核酸分子递送至有害生物的新的细胞递送分子以及这些分子的各种用途。具体地，在第一方面，本专利技术涉及由(核糖)核苷酸序列构成的多结构域RNA分子，其包含-至少一个适配子(aptamer)，和-至少一个形成双链RNA的感兴趣核苷酸序列，所述双链RNA包含退火后的互补链，其中一条链包含与有害生物靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。与特定基因具有同源性的双链RNA分子已显示通过RNA干扰导致所述特定靶基因的沉默。在本专利技术中，我们描述了核苷酸序列的概念和设计，所述核苷酸序列包含连接至能够触发特定靶基因的基因沉默的dsRNA分子的RNA适配子序列。连接至dsRNA分子的适配子序列此处也称作嵌合适配子-dsRNA分子。这些嵌合适配子-dsRNA分子可在体外通过化学合成或通过从DNA模板体外转录来制备，或可在体内从转基因DNA或RNA表达。这些嵌合适配子-dsRNA分子在沉默目的上比常规已知的构建体更有效，因为适配子部分可以1.结合至特定的跨膜蛋白，从而改进表达所述靶基因的细胞通过内吞作用对dsRNA的结合和吸收；2.使得能够通过转胞吞作用或其他转运机制将dsRNA转移至其他靶组织，从而允许所述dsRNA分子的全身性扩散。3.结合至特定的肠道(gut)细胞蛋白(例如毒素受体、线虫和昆虫中诱导苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)抗性的蛋白质(例如，Cry蛋白、糖基转移酶蛋白、果蝇EGGHEAD和BRAINIAC)，等)，从而改进所述dsRNA内化至有害生物肠道或消化道衬层的细胞内。4.结合至肠细胞表面分子(碳水化合物如N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNac)和甘露糖、无脊椎动物特异性糖脂等)，从而使所述dsRNA更紧密地与细胞-壁和/或有害生物消化道衬层细胞上的受体接触；5.结合至特定的植物蛋白或(亚)细胞结构，从而高效地在生产细胞中积累和/或浓缩dsRNA；6.将dsRNA靶向宿主细胞或生物体中的(亚)细胞结构；7.保护dsRNA免受Dicer的加工或被生产细胞中的其他核酸酶降解；8.保护dsRNA分子在细胞外环境中免受降解。本专利技术的其他优点包括容易将双链RNA导入细胞或组织，可使用的RNA的低浓度，双链RNA的稳定性和抑制的有效性。因此，本专利技术的多结构域RNA分子提供了用于需要递送dsRNA至靶有害生物的各种农学和研究应用的强有力工具。本专利技术还提供了使用此处描述的多结构域RNA分子的多种方法，包括帮助递送双链核糖核苷酸分子至有害生物的方法和用于在有害生物物种中下调靶基因表达的方法。因此，在另一方面，本专利技术涉及用于递送双链RNA分子至有害生物物种的方法，其包括-在植物细胞或植物中表达至少一种本专利技术的多结构域RNA分子，和-给所述有害生物物种喂食所述植物细胞或植物。在另一个实施方案中，本专利技术涉及用于递送双链RNA分子到有害生物物种的方法，其包括-在植物细胞或植物中表达至少2种本专利技术的多结构域RNA分子，且其中各多结构域RNA分子包含与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火后的互补链，其中一条链具有与所述靶基因的靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列，和-给所述有害生物物种喂食所述植物细胞或植物。在另一个方面，本专利技术涉及用于在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，其包括-在植物细胞或植物中表达至少一种本专利技术的多结构域RNA分子，和-给所述有害生物物种喂食所述植物细胞或植物。在另一个实施方案中，本专利技术提供用于在有害生物物种中下调靶基因表达的方法，其包括-在植物细胞或植物中表达至少2种本专利技术的多结构域RNA分子，其中各多结构域RNA分子包含与另一种多结构域RNA分子的单链RNA形成双链RNA的单链RNA，所述双链RNA包含退火后的互补链，其中一条链具有与要被下调的靶基因的靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列，和-给所述有害生物物种喂食所述植物细胞或本文档来自技高网...

【技术保护点】
由核苷酸序列组成的多结构域ＲＮＡ分子，其包含：　　　　－至少一个适配子，和　　　　－至少一个形成双链ＲＮＡ的感兴趣核苷酸序列，所述双链ＲＮＡ包含退火的互补链，其中一条链包含与有害生物靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒂埃里安德烈奥利维耶埃迪博盖尔特，帕斯卡莱费尔德曼，格特普莱廷克，
申请(专利权)人：德福根有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]