一种HCMV pp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术属于生物医学领域，特别是用于HCMV活动性感染诊断的一种HCMV pp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒及其检测方法。该方法先用HCMV重组pp65抗原包被酶标反应板，然后加入待测样本和HRP标记的HCMV pp65多克隆抗体或单克隆抗体进行反应，通过测定HRP标记的HCMV pp65多克隆抗体或单克隆抗体的量显示竞争ELISA检测结果。该发明专利技术试剂盒与荷兰IQ公司的pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒分别对40份试验样品进行了平行试验，两种方法检测符合率为100％，相比pp65抗原血症免疫荧光法检测试剂盒，本发明专利技术试剂盒具有操作简便、特异性和敏感性高等特点，为HCMV活动性感染检测提供了一种有效技术手段。

A test kit for HCMV pp65 antigenic competition inhibition ELISA method and its detection method

【技术实现步骤摘要】
一种HCMVpp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物医学领域，特别是用于HCMV活动性感染诊断的一种HCMVpp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
人巨细胞病毒(humanCytomegalovirus,HCMV)属于疱疹病毒β亚科，为双链DNA病毒。在全球范围成人血清抗体阳性率为60～90％以上。在发展中国家，约有80％儿童在2岁以前就已经感染该病毒，至成年几乎所有人已感染。HCMV的原发感染多发生在20岁以前，大多为隐性感染，不引起严重的症状。与所有的疱疹病毒一样，一旦发生感染，HCMV会在宿主体内(唾液腺、白细胞等处)建立持续终生的潜伏感染，潜伏感染常会间断性地被激活而发生复发性感染。HCMV感染在免疫正常者大多无临床症状，但免疫功能低下者(AIDS患者、器官和细胞移植受者)则为致命性感染，导致死亡；孕妇妊娠期原发性CMV感染可能经过胎盘血路感染胎儿，导致胎儿出生缺陷，如神经性耳聋(SNHI)和智力发育迟缓等。对HCMV易感人群中，常引起显性感染，其主要临床症状有：发烧、白细胞减少症、乏力、肝炎、肺炎、胃肠病、视网膜炎等；近期的研究表明，在临床众多的炎症性疾病和肿瘤疾病中，HCMV同样扮演着重要角色。如已发现，HCMV与动脉粥样硬化有密切的相关性，HCMV潜伏感染的再激活可引起病毒介导的血管炎症反应增强，血管平滑肌细胞增生等。由于HCMV活动性感染时发生的临床症状没有特征性，因此，仅凭临床经验医生难以及早做出明确诊断，而早期治疗却对于HCMV感染患者的预后至关重要:可以大大降低患者血流中的病毒载量，减少对机体的病理损害。但传统病毒分离培养法虽然被认为是HCMV活动性感染诊断的“金标准”，由于需要4周左右才能判定结果，无法进行早期诊断；而市场上用于检测HCMV特异性IgM抗体的ELISA试剂盒，可能会因为免疫抑制患者特异性抗体应答能力的减弱或抗体延迟出现，导致出现假阴性而检出率低。根据目前临床实践显示，可以通过检测患者HCMVpp65抗原血症，以准确检测临床不同易感人群(尤其是免疫功能低下人群)的人巨细胞病毒活动性感染状态。但全球仅荷兰IQProducts生产的CMVBriteTMTurboKit获得了FDA的批准，可正式用于临床检测，但该产品难以被我国医院检验科接受，主要原因在于该试剂盒采用免疫荧光法，操作特别繁琐，检测过程需要4h以上，不适合大量临床样本检测。本专利技术以安徽医科大学微生物学教研室四代科研人员数十年对HCMV的深入研究而建立的重组蛋白与单克隆抗体研发平台为基础，将荷兰IQProducts生产的CMVBriteTMTurboKit产品质量标准作为模板，进行检测方法学升级换代，将原来的免疫荧光法改为操作简便、特异性好和敏感性高的ELISA法，研制了人巨细胞病毒pp65抗原血症ELISA检测试剂盒。该试剂盒所用核心原料HCMVpp65多克隆抗体和阳性参考品均为自行制备，具有自主知识产权。
技术实现思路
一种HCMVpp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒，该试剂盒主要含有：HCMVpp65重组抗原包被酶标反应板、HRP标记特异性HCMVpp65多克隆抗体或单克隆抗体、样品稀释液、辣根过氧化物酶底物显色液、终止液、阳性对照品、阴性对照品组成。优选地，所述HCMVpp65重组抗原是以HCMVAD169毒株基因组为模板，用针对HCMVpp65基因设计的特异性引物进行PCR扩增，再将扩增得到的HCMVpp65基因与表达质粒pET-32a连接后导入大肠杆菌BL21中原核表达获得。优选地，所述特异性引物中，上游引物序列为5’-GGATCCATGGAGTCGCGCGGTC-3’，下游引物序列为5’-GAGCTCACCTCGGTGCTTTTT-3’，上下游引物分别引入BamHI和SacI酶切位点。优选地，所述扩增的HCMVpp65目的基因的核酸序列如SEQIDNO:1所示。该竞争ELISA检测方法步骤包括：样品稀释、抗原包被、封闭、混合、反应、显色与终止、数据检测与处理，其具体操作如下：步骤1)样品稀释：将血清样品稀释为原体积的2～4倍，得到待测血清样品；步骤2)抗原包被：用HCMVpp65重组抗原包被酶标反应板，包被抗原的包被浓度为100～1000ng/孔；步骤3)封闭：用含1～10％小牛血清的PBS缓冲液封闭步骤2)的酶标反应板，37℃温箱封闭30～60min；步骤4)混合：将步骤1)得到的待测血清样品、不同浓度梯度阳性对照品或阴性对照品分别与HRP标记特异性HCMVpp65多克隆抗体或单克隆抗体混合，37℃温箱反应30～60min；步骤5)反应：将步骤4)得到的混合反应液体加入到步骤3)的酶标反应板中，37℃温箱反应30～60min；步骤6)显色与终止：在步骤5)得到的酶标反应板中加入新鲜配制的底物溶液，振荡混合后室温避光孵育10～20min进行显色，再每孔加入终止液，在450nm处测定吸光值OD450nm；步骤7)数据处理：利用不同浓度梯度阳性对照品得到的吸光值进行线性拟合，得到试剂盒的标准曲线；将待测血清样品测定的吸光值带入标准曲线计算出待测样品血清中HCMVpp65蛋白含量；利用待测血清样品和阴性对照品测定的吸光值计算待测血清样品的抑制率并进行判定。优选地，所述抑制率的计算通过以下公式进行：抑制率＝100×(1-OD待检样品/OD阴性对照)％；其中OD阴性对照为HRP标记特异性HCMVpp65抗体和阴性对照品混合的板孔的OD450值；OD待检样品为加入了HRP标记特异性HCMVpp65抗体和待检血清样品的板孔的OD450值；判定待检血清样品：抑制率≥30％，则判定待检血清样品为阳性。本专利技术的有益效果在于：本研究所述一种HCMVpp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒及其检测方法，采用HCMVpp65抗原包被酶标反应板，特异性高、灵敏度强、包被效果好；检测过程中先将待测样品与抗体混合反应，再加入到包被有抗原的酶标反应板中，使样品能够充分反应，提高了检测的准确性；该方法与荷兰IQ公司的pp65免疫荧光方法分别对40份阳性和阴性试验样品进行了平行试验，两种方法检测符合率为100％，与其它几种疱疹病毒参考阳性血清无交叉反应。其意义在于具有操作简便、特异性和敏感性高等特点，为HCMV活动性感染检测提供了一种有效技术手段。附图说明图1为本专利技术试剂盒检测的标准曲线。具体实施方式为了实现本专利技术的技术方案，本专利技术采用了如下具体实施方式。实施例1HCMVpp65重组抗原的制备1.HCMVpp65基因与pET-32a载体的连接：HCMVAD169毒株由安徽医科大学微生物学教研室提供。用针对HCMVpp65基因设计的特异性引物进行PCR扩增，上游引物序列为5’-GGATCCATGGAGTCGCGCGGTC-3’，下游引物序列为5’-GAGCTCACCTCGGTGCTTTTT-3’，上下游引物分别引入BamHI和SacI酶切位点，目的基因片段长度为1686bp。用BamHI和SacI分别双酶切pp65基因片段和pET-32a载体，在0.5mlEP管中加入双酶切过的pp65基因片段和pET-32a载体、连接缓冲液及T4连接酶至总体积本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种HCMV pp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：HCMV pp65重组抗原包被的酶标反应板、HRP标记的特异性HCMVpp65多克隆抗体或单克隆抗体、样品稀释液、辣根过氧化物酶底物显色液、终止液、阳性对照品、阴性对照品。

【技术特征摘要】
1.一种HCMVpp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：HCMVpp65重组抗原包被的酶标反应板、HRP标记的特异性HCMVpp65多克隆抗体或单克隆抗体、样品稀释液、辣根过氧化物酶底物显色液、终止液、阳性对照品、阴性对照品。2.根据权利要求1所述的一种HCMVpp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒，其特征在于，所述HCMVpp65重组抗原是以HCMVAD169毒株基因组为模板，用针对HCMVpp65基因设计的特异性引物进行PCR扩增，再将扩增得到的HCMVpp65基因与表达质粒pET-32a连接后导入大肠杆菌BL21中原核表达获得。3.根据权利要求2所述的一种HCMVpp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒，其特征在于：所述特异性引物中，上游引物序列为5’-GGATCCATGGAGTCGCGCGGTC-3’，下游引物序列为5’-GAGCTCACCTCGGTGCTTTTT-3’，上下游引物分别引入BamHI和SacI酶切位点。4.根据权利要求2所述的一种HCMVpp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒，其特征在于：所述扩增的HCMVpp65目的基因的核酸序列如SEQIDNO:1所示。5.利用权利要求1～4任一项所述的HCMVpp65抗原血症竞争抑制ELISA法检测试剂盒的检测方法，该竞争ELISA检测方法步骤包括：样品稀释、抗原包被、封闭、混合、反应、显色与终止、数据检测与处理，其特征在于，步骤1)样品稀释：将血清样品稀释为原体积的2～4倍，得到待测血清样品；步骤2)抗原包...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明丽，陈鲲鹏，赵俊，张文昌，鲁江徽，
申请(专利权)人：王明丽，
类型：发明
国别省市：安徽,34