基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，样品稀释液、显色液以及洗涤液。本发明专利技术建立的FAdV‑4抗体的间接ELISA试剂盒能特异性的检测出FAdV‑4抗体，而与抗流感病毒血清(AIV)、抗马立克病毒血清(MDV)、抗新城疫病毒血清(NDV)、抗禽网状内皮组织增生症病毒血清(REV)以及SPF鸡血清不反应(图6)。因此，该试剂盒具有良好FAdV‑4的特异性，能用于FAdV‑4感染及免疫状况流行病学调查。

【技术实现步骤摘要】
基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。
技术介绍
禽腺病毒(FowlAdenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前国内FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性血清4型FAdV(FAdV-4)在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无针对FAdV-4血清学抗体检测的快速方法及其试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。本专利技术的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了禽腺病毒F2基因的原核表达质粒，之后将该质粒转化入BL21细胞进行原核表达并纯化并进一步将纯化的蛋白作为包被抗原建立试剂盒，检测血清4型禽腺病毒特异性抗体。实现本专利技术目的的技术方案是：本专利技术所述的一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，样品稀释液、显色液以及洗涤液。进一步地，所述包被有表达F2蛋白的ELISA酶标板，是通过将纯化的F2基因原核表达产物包被于96孔ELISA酶标板而制备。本专利技术所述基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，可以通过下述步骤得到：(1)禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后按1:5的比例加入PBS制成悬液；经0.45um微孔滤器过滤后，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为血清4型禽腺病毒后，－20℃保存；(2)禽腺病毒基因组的制备：首先将血清4型禽腺病毒分离毒株病毒经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无水乙醇沉淀，溶于30uL灭菌超纯水，即得禽腺病毒基因组，置-20℃备用；(3)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及FAdV-4病毒F2蛋白基因片段：设计出扩增血清4型禽腺病毒F2基因的引物以及pGEX-6p-1线性化载体的引物；以pGEX-6p-1原核表达载体以及禽腺病毒基因组为模板，利用相应引物分别PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒F2基因序列；(4)p-FAdV-F2重组表达载体构建：利用重组酶ExnaseTMII将线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒F2基因的PCR产物进行快速体外重组克隆，重组克隆经序列验证后，命名为p-FAdV-F2，挑取细菌克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定，鉴定的阳性克隆转化到BL21细胞中进行诱导表达。(5)F2原核表达质粒的表达及其产物的免疫反应性鉴定：扩增阳性克隆的BL21细胞，并以1：100接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h以后加入IPTG进行诱导表达，5h后收集细菌，用PBS重悬后40Hz，间隔8s进行破碎，破碎完成后离心分上清和沉淀。图3为本专利技术SDS-PAGE分析GST-F2的表达示意图，SDS-PAGE分析破碎后的上清和沉淀，可见表达产物部分在上清中，部分在沉淀中以包涵体的形式存在。之后利用Western-blot分析表达产物与阳性血清的反应性(如图4所示)。(6)制备检测禽腺病毒抗体的抗原:将BL21表达的融合表达产物GST-F2上清经GST标签亲和层析柱纯化后得到纤突蛋白基因F2的表达蛋白。图5为SDS-PAGE分析纯化的F2蛋白表达产物。(7)检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒：该试剂盒成分包括包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照(阳性对照为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清)，HRP标记的兔抗鸡二抗(购买所得)，样品稀释液(含0.05％Tween-20的PBST)，显色液(TMB显色液以)及洗涤液(含0.05％Tween-20的PBST)。该试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将阳性血清1：100稀释后，加入A1、A2孔，将阴性血清1：100稀释后加入A3、A4孔，剩下的的孔用于检测待检样品(1：400稀释)，37度反应1小时；PBST洗涤3遍后，加入工作浓度的HRP标记的兔抗鸡抗体，37度反应1小时；PBST洗涤3遍后，进行显色10分钟，之后加入终止液终止显色。读取OD450吸光值,OD450大于0.2的孔判为阳性。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术建立的FAdV-4抗体的间接ELISA试剂盒能特异性的检测出FAdV-4抗体，而与抗流感病毒血清(AIV)、抗马立克病毒血清(MDV)、抗新城疫病毒血清(NDV)、抗禽网状内皮组织增生症病毒血清(REV)以及SPF鸡血清不反应(图6)。因此，该试剂盒具有良好FAdV-4的特异性，能用于FAdV-4感染及免疫状况流行病学调查。附图说明图1是本专利技术PCR扩增线性化pGEX-6p-1载体示意图(泳道1：线性化的pGEX-6p-1载体；泳道M：1KbDNALadder)。图2是本专利技术PCR扩增F2目的片段示意图(泳道1：禽腺病毒F2基因；泳道M：100bpDNALadder)。图3是本专利技术SDS-PAGE分析GST-F2的表达示意图(泳道1：蛋白Marker；泳道2：GST上清；泳道3：GST沉淀；泳道4：GST-F2表达产物破碎上清；泳道5：GST-F2表达产物破碎沉淀)。图4是本专利技术Western-blot分析表达产物的反应性示意图(泳道1：GST-F2表达产物破碎上清；泳道2：GST-F2表达产物破碎沉淀；泳道3：阴性对照GST上清；泳道4：阴性对照GST沉淀；泳道5：蛋白Marker)。图5是本专利技术SDS-PAGE分析纯化的GST-F2的表达产物示意图(泳道1:纯化的GST-F2表达产物；泳道2：蛋白Marker；泳道3：阴性对照GST上清；泳道4：阴性对照GST沉淀；泳道5：未纯化GST-F2的表达产物破碎上清；泳道6：未纯化GST-F2的表达产物破碎沉淀)。图6是本专利技术检测FAdV-4抗体的间接ELISA试剂盒特异性检测示意图。具体实施方式下面将通过附图和具体实施方例对本专利技术做进一步的具体描述，但不能理解为是对本专利技术保护范围的限定。实施例1本专利技术所述基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，可以通过下述步骤得到：(1)FAdV-4禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5的比例加入PBST制成悬液；5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和链霉素各1000IU/ml，37℃反应30min；经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为FAdV-4禽腺病毒后，－20℃保存。(2)禽腺病毒基因组的制备：取本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，样品稀释液、显色液以及洗涤液。

【技术特征摘要】
1.一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，样品稀释液、显色液以及洗涤液。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，是通过将纯化的F2基因片段原核表达产物包被于96孔ELISA酶标板而制备。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述纤突蛋白基因F2的表达蛋白通过以下步骤得到：(1)禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后按1:5的比例加入PBS制成悬液；经微孔滤器过滤后，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为血清4型禽腺病毒后，－20℃保存；(2)禽腺病毒基因组的制备：首先将血清4型禽腺病毒分离毒株病毒经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无水乙醇沉淀，溶于30uL灭菌超纯水，即得禽腺病毒基因组，置-20℃备用；(3)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及FAdV-4病毒F2蛋白基因片段：设计出扩增血清4型禽腺病毒F2基因的引物以及pGEX-6p-1线性化载体的引物；以pGEX-6p-1原核表达载体以及禽腺病毒基因组为模板，利用相应引物分别PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒F2基因序列；(4)p-FAdV-F2重组表达载体构建：利用重组酶ExnaseTMII将线性化的pGEX-6...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，王伟康，邵红霞，秦爱建，田晓彦，梁广成，万志敏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32