适用于产生和制备重组双链RNA核壳的细菌包装菌株及其用途制造技术

本发明专利技术公开了适用于产生重组双链ＲＮＡ核壳（ｒｄｓＲＮｓ）的细菌包装菌株。所述包装菌株可用于制备在真核细胞或组织中编码疫苗抗原，生物活性蛋白，免疫调节蛋白，反义ＲＮＡ，以及催化ＲＮＡ的ＲＮＡ。本发明专利技术还公开了将重组ｓｓＲＮＡ导入所述菌株并进行包装从而以从头合成的方式形成ｒｄｓＲＮｓ。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了适用于产生重组双链RNA核壳(rdsRNs)的细菌包装菌株，其可用于产生在真核细胞或组织中编码疫苗抗原，生物活性蛋白，免疫调节蛋白的RNA，反义RNA以及催化RNA。特别地，本专利技术还提供了细菌包装菌株，可向其中导入重组ssRNA并进行包装从而以从头合成的方式形成rdsRN，所述rdsRN可在所述包装菌株内复制并由此制备目的RNA。
技术介绍
病毒核壳，即病毒的核蛋白核心，具有诸多特征，这些特征可以使其具有在生物系统内表达异源基因序列的价值。由于缺乏完整病毒的外膜和粘附素，核壳是非感染性的颗粒，由病毒核心的蛋白和遗传物质构成，其保留了壳体化和复制核酸序列的能力。因此，可以通过去除亲代病毒的编码膜，粘附素，蛋白酶，以及其他感染性或细胞溶解性因子的序列来减轻传染或环境散播的风险。通过对在其复制循环中不表现出DNA阶段的病毒前体进行选择，RNA核壳还可进一步增强这些基因表达系统的安全性，由此降低在导入时，外源核苷酸序列整合入所述细胞或有机体基因组的风险。通过在这些核壳表达系统设计中利用双链RNA(在本文中为“dsRNA”)，可以克服RNA的内在不稳定性。此外，非核壳序列的去除以及dsRNA病毒基因组的典型片段化使得利用人工基因组片段来替换缺失序列和编码异源RNA的设计成为了颇具吸引力的方法，采用该方法可以表达目的基因或者将目的RNA递送入生物系统中。由此可设计出重组核壳表达系统，因而其可含有仅编码产生其他核壳所必需的序列，目的异源序列，以及其在细胞中进行增殖和制备所必需的序列。囊病毒(cystoviridae)科的双链RNA噬菌体(在本文中为“dsRP”)是原型(prototypical)dsRNA病毒(Sinclair等，J Virol.16685；1975)；(Mgraw等，J Virol.58142；1986)；(Gottlieb等，Virology 163183；1988)；(Mindich等，J Virol.621180；1988)；(Mindich，Microbiol.MoI.Biol.Rev.63，149；1999)。囊病毒科dsRP的区别性特征是由三种双链RNA片段(Mcgraw等，上文所述的，1986)；(Gottlieb等，上文所述的，1988)；(Mindich等，上文所述的，1988)指定的片段-L，片段-M和片段-S构成的基因组，以及含脂的膜被(membrane coat)(Sands andLowlicht，Can J Microbiol，22154；1976)；(Bamford，and Palva，Biochim Biophys Acta，601245；1980)。基因组片段包含于核壳核心之内，其包括蛋白P1，P2，P4和P7，并且由编码dsRNA片段-L的基因(例如GenBank Accession#AF226851)所制备。正链RNA(在本文中为“mRNA”)的合成发生在核壳之内，并且是由在片段-L上的基因-2部分编码的RNA-依赖的RNA聚合酶所完成(Mindich等，上文所述的，1988)；(Van Etten等，J Virol，12464；1973)；片段-L上的基因-7也在mRNA合成的过程中发挥了作用(Mindich，等，上文所述的，1999)。DsRP phi-6，dsRNA噬菌体这一科的原祖型(archetype)，通常会感染丁香假单胞杆菌(Pseudomonas syringae)(Mindich，等，上文所述的，1999)，然而，最近分离到的dsRP phi-8，phi-11，phi-12和phi-13可以感染大肠杆菌菌株JM109(美国典藏中心(在本文中为“ATCC”)#53323)，以及肠炎沙门氏菌鼠伤寒血清型(Salmonella enterica)serovarTyphimurium)的O-抗原阴性突变体(在本文中指定为“鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium”))并在其中进行某种程度的复制(Mindich等，上文所述的，1999)；(Mindich等，J.Bacteriol，1814505；1999)；(Hoogstraten等，Virology，272218；2000)；(Qiao等，Virology 275218；2000)。原祖型dsRP phi-6在细菌中的生活周期早已公开(Mindich，AdvVirus Res，35137；1988)；(Mindich，等，上文所述的，1999)。Phi-6通过结合于鞭毛从而允许与宿主细胞膜接触进而感染宿主，由此导致了融合，与此同时核壳被导入周质。核壳随后被转移至细胞质中，这是一个需要蛋白P5的内肽酶活性以及蛋白P8的转移性质的事件。有意思的是，具有完整P8壳的核壳能够自发地进入细菌的原生质体，从而导致了细菌菌株的自发转染，由此制备出原生质体(Qiao等，Virology227103；1997)；(Olkkonen等，Proc.Natl.Acad.Sci.879173；1990)。在进入细胞质时，P8会脱壳，而剩余的核壳，其含有三种dsRNA片段并具有RNA-依赖的RNA聚合酶活性，则开始合成dsRNA片段L，M和S的mRNA拷贝。由片段-L产生的蛋白主要与前衣壳制备相关；片段-M则主要涉及附着蛋白的合成，而片段-S则产生前衣壳的壳蛋白(P8)，溶解性内肽酶(P5)，以及涉及脂包膜生成的蛋白(P9和P12)(Johnson and Mindich，J Bacteriol，1764124；1994)。dsRNA片段的包装是顺序进行的，其中片段-S被识别并被空的前衣壳所容纳；含有了片段-S的前衣壳不再结合这一片段但现在能够结合并容纳片段-M；含有了片段S和M的前衣壳不再结合这些片段但现在能够结合并容纳片段-L，从而产生核壳。一旦核壳含有了全部的三种单链RNA(在本文中为“ssRNA”)片段，那么负RNA链的合成就开始了从而制备出dsRNA片段。核壳随后与蛋白5和8相连，并最终被包含于脂膜内，从而完成了噬菌体的装配。一般认为宿主细胞的裂解是由于膜裂解蛋白P10，片段-M的产物积累而发生的，并且需要内肽酶P5(Mindich等，上文所述的，1999)。dsRP前衣壳中的装配和RNA聚合酶活性并不需要宿主蛋白，因为从能够表达片段-L cDNA拷贝的大肠杆菌JM109衍生物纯化得到的前衣壳能够包装纯化的ssRNA片段L，M和S(Mindich等，上文所述的，1999)；(Qiao等，上文所述的，1997)。在上述体外系统中，在吸收了ssRNA片段之后，核糖核苷酸的加入导致了负链合成以及成熟dsRNA片段的产生。此外，在dsRNA合成完成之后，P8会与核壳相连，并且，如上所述，所得产物能够进入细菌原生质体并产生有效感染；(Qiao等，上文所述的，1997)。以往的研究描述了重组dsRP(在本文中被称为“rdsRP”)的产生(Mindich，Adv Virus Res 53341；1999)；(Onodera等，J Virol 66190；1992)。可通过向dsRP phi-6的片段-M中插入卡那霉素抗性等位基因从而构建简单的rdsRP。可通过感染携带有表达含野生型dsRPphi-本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于包装，产生和／或递送基因或ＲＮＡ的细菌菌株，包含：　　　　ａ）含有至少一种选择性表型突变的基因组ＤＮＡ；　　　　ｂ）编码产生核壳所必需基因的核酸序列；　　　　ｃ）包含具有ＲＮＡ包装和ＲＮＡ聚合酶活性的蛋白的一种或多种核壳；以及　　　　ｄ）包含在所述一种或多种核壳内部的ｄｓＲＮＡ序列，所述ｄｓＲＮＡ序列至少编码：　　　　ｉ）弥补所述至少一种选择性表型突变的基因产物，以及　　　　ｉｉ）可操作连接于真核翻译起始序列的目的ＲＮＡ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫迈克尔霍恩，约翰富尔克松，杰拉尔德C萨多夫，大卫奥尼亚贝，米谢勒斯通，
申请(专利权)人：AERAS全球TB疫苗基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]