一种在离体培养下诱导伊犁贝母多倍体的方法技术

本发明专利技术涉及一种在离体培养下诱导伊犁贝母多倍体的方法，该方法利用新鲜鳞茎诱导产生不定芽，通过含有不同浓度秋水仙素的ＭＳ液体培养基进行诱导处理，诱导产生多倍体伊犁贝母植株，通过改变染色体倍性使植株产生优良性状以提高其鳞茎产量及药用成分的含量，通过多倍体的筛选鉴定得到多倍体伊犁贝母，克服伊犁贝母在长期种植中出现品种退化问题。此方法可快速获得多倍体伊犁贝母，有效提高活性成分的含量，缩短种植周期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药用植物育种领域，具体地说，涉及一种伊犁贝母多 倍体诱导方法。
技术介绍
伊犁贝母(/^j'z^7Za/7'a尸aL^Vj'/7ora Schrenk)，百合科 a^iaceae)贝母属(j77arh L.)多年生草本植物，以鳞茎入药，是一味重要的常用中药，具有清热润肺、化痰止咳的功效。由 于伊犁贝母生物碱的含量在同类贝母中相对较高，并且抗病力强，药材价格相对较低，近年来倍受人们的关注。伊犁贝母在新疆及内地均 有种植，已成为一种重要的中草药及经济创收作物。然而，人工栽培 的伊犁贝母存在繁殖系数低、品质退化的问题，野生伊犁贝母长期以 来被大量采挖，分布面积日益縮减，资源破坏严重，因此探求伊犁贝 母新种质资源的研究越来越受到人们的重视。伊犁贝母主要成分为异甾体生物碱及其苷，主要包括D， E环双氢 顺式的西贝素和新甾体生物碱一新贝甲素等，其中D， E环双氢顺式西 贝素属西藜芦碱类(cevine groups),为伊贝母中主要生物碱之一， 尤以西贝素(imperialine)和西贝素苷(imperialine-3 P -D-glucoside)为主要成分(伊江兰，麦迪尼亚提 伊贝母总生物碱的研究概述新疆中医药2002 4)。到目前为止，从 伊犁贝母总生物碱中已经分离到单体生物碱有:西贝素(Imperialine)， 西贝素苷(imperialine-3 P -D-glucoside)， 贝 母辛(Peimisine)，伊贝碱苷A(Yibeinoside A)，伊贝碱苷B (Yibeinoside B)，伊贝碱苷C(Yibeinoside C)，伊贝辛(Yibeisine)。伊犁贝母总生物碱的镇咳、祛痰和平喘研究方面，王林辉等以小鼠、豚鼠、猫和大鼠作为测试对象，在10 mg/kg剂量下，十二指肠 给药对电刺激猫喉上神经引咳具有显著的镇咳作用。连续灌胃给药5 d，伊犁贝母总生物碱在40,20, 10mg/kg的剂量下对小鼠氨水引咳具 有显著的镇咳作用；在20， 10mg/kg的剂量下对豚鼠枸橼酸引咳具有 显著的镇咳作用，能显著增加大鼠毛细管排痰量；在40，20 mg/kg 的剂量下具有显著增加小鼠酚红排泌量的作用，对乙酰胆碱.组胺所 致的豚鼠哮喘具有显著的平喘作用。结果表明伊犁贝母总生物碱对实 验动物具有显著的镇咳、祛痰及平喘作用。这与中医的清热润肺、化 痰止咳的功效相吻合(王林辉,季晖，王长礼，何倩，李萍伊犁贝母总 生物碱的药效学研究中国药科大学学报2003 34 172-176)。多倍体植物由于染色体加倍，往往具有根茎叶的巨大性，即根茎 叶的产量较高，能较好地满足药材生产的要求；另一方面，植物染色 体倍性的变化，也往往会导致次生代谢产物含量的变化，有可能获得 有效成分含量高的药用植物。同时多倍体植株生态适应性及对逆境的 抗性也有所增强(Sandra De Schepper " s丄 Somatic polyploid petals: regeneration offers new roads for breeding Belgian pot azaleas /^/朋t Ce7厶 7j's犯e a/ t/ Qr卵/ 6Wti/re 76: 183 - 188; M. Lotfi e"丄Production of haploid and doubled h即loid plants of melon (6"〃c"啦'5"/Z7e7c) L.) for use in breeding or multiple virus resistance Plant Cell R印(2003) 21:1121 - 1128; M. J. Kermani Oryzalin-induced chromosome doubling in Rosa and its effect on plant morphology and pollen viability Theor Appl Genet (2003) 107:1195 - 1200)。贝母属植物多倍体育种研究较少，王志安等利用秋水仙素处理浙 贝种子进四倍体的育种研究(王志安许复华诱导浙贝母多倍体的研 究初报浙江农业大学学报1991 17(1) 89 92)。王强等用秋水仙素对川贝母(,riWL ar/a ci7T力osa D. Don)愈伤组织进行四倍体诱导 (王强，兰利琼，傅华龙秋水仙素诱导川贝母(/^'"'Wsz^ "7r力osa D.Don)愈伤组织多倍体的研究武汉植物学研究 2002,20(6) :449-452)。在伊犁贝母育种中，本专利技术结合伊贝母鳞茎切块不定芽快速诱导 与增殖技术，利用秋水仙素处理不定芽使染色体加倍，诱导产生多倍 体伊犁贝母植株，通过改变染色体倍性使植株产生优良性状以提高其 鳞茎产量及药用成分的含量，克服伊犁贝母在长期种植中出现品种退 化问题。这对扩大新疆特有珍稀经济类作物种植面积，提高贝母种植 收入，推广常用中药开发利用有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在离体培养下诱导伊犁贝母多倍体 的方法，该方法利用新鲜鳞茎切块诱导产生不定芽，通过含有不同浓 度秋水仙素的MS液体培养基进行诱导处理，诱导产生多倍体伊犁贝母植株，通过改变染色体倍性使植株产生优良性状以提高其鳞茎产量及 药用成分的含量，通过多倍体的筛选鉴定得到多倍体伊犁贝母，克服 伊犁贝母在长期种植中出现品种退化问题。此方法可快速获得多倍体 伊犁贝母，有效提高活性成分的含量，縮短种植周期。专利技术所述的，按下列 步骤进行a、 将伊犁贝母新鲜鳞茎用自来水冲洗净表面，大鳞茎于太阳下 晾晒12—24h，小鳞茎晾晒8—12h，然后将鳞茎在超净工作台上采 用75%酒精时间30s或0. 1_1%高锰酸钾水溶液处理1 h或84消毒 液浸泡20 min进行表面消毒，然后用0. 1%升汞6—10 min或3-5 %次氯酸钠水溶液处理5-10 min，再用15%双氧水处理30—60 min， 无菌水冲洗2—3次；b、 将步骤a中处理后的鳞茎切成0. 1—0. 2cm3大小接入不定芽诱 导与增殖固体培养基MS+KT 0.5—1.0 mg/L + NAA 0. 1—0.4 mg/L，温度20士1 。C，光照2000 lx，时间18 h/d进行培养；c、 将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，浸泡在含有秋水仙素 50—1000 mg/L， 2X二甲基亚砜的液体MS培养基中，浸泡12—48 h 进行多倍体的诱导；d、 将步骤b中伊犁贝母不定芽切成单芽，浸泡在不加秋水仙素 的MS液体培养基，置于转速为100r/min摇床上浸泡，浸泡12—48 h;e、 将步骤c和d单芽分别用无菌水冲洗2—3次后，于无菌的滤 纸上15—25 min晾干后转入步骤b不含秋水仙素和二甲基亚砜的不 定芽诱导与增殖固体培养基MS+KT 0. 5—1.0 mg/L + NAA 0. l—O. 4 mg/L中培养；f、 伊犁贝母多倍体筛选多倍体伊犁贝母的筛选根据二倍体与 秋水仙素处理后不定芽在叶片宽度、叶面积、气孔保卫细胞大小及密 度确定疑似株，将疑似株转入1/2 MS+NAAO. 5—1. Omg/L生根培养基 中生根；g、 伊犁本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在离体培养下诱导伊犁贝母多倍体的方法，其特征在于按下列步骤进行：ａ、将伊犁贝母新鲜鳞茎用自来水冲洗净表面，大鳞茎于太阳下晾晒１２－２４ｈ，小鳞茎晾晒８－１２ｈ，然后将鳞茎在超净工作台上采用７５％酒精时间３０ｓ或０．１－１％高锰酸 钾水溶液处理１ｈ或８４消毒液浸泡２０ｍｉｎ进行表面消毒，然后用０．１％升汞６－１０ｍｉｎ或３－５％次氯酸钠水溶液处理５－１０ｍｉｎ，再用１５％双氧水处理３０－６０ｍｉｎ，无菌水冲洗２－３次；ｂ、将步骤ａ中处理后的鳞茎切成０．１－０． ２ｃｍ↑［３］大小接入不定芽诱导与增殖固体培养基ＭＳ＋ＫＴ０．５－１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１－０．４ｍｇ／Ｌ，温度２０±１℃，光照２０００１ｘ，时间１８ｈ／ｄ进行培养；ｃ、将步骤ｂ中伊犁贝母不定芽切成单芽，浸泡在含有秋水仙素５０－ １０００ｍｇ／Ｌ，２％二甲基亚砜的液体ＭＳ培养基中，浸泡１２－４８ｈ进行多倍体的诱导；ｄ、将步骤ｂ中伊犁贝母不定芽切成单芽，浸泡在不加秋水仙素的ＭＳ液体培养基，置于转速为１００ｒ／ｍｉｎ摇床上浸泡，浸泡１２－４８ｈ；ｅ、将步 骤ｃ和ｄ单芽分别用无菌水冲洗２－３次后，于无菌的滤纸上１５－２５ｍｉｎ晾干后转入步骤ｂ不含秋水仙素和二甲基亚砜的不定芽诱导与增殖固体培养基ＭＳ＋ＫＴ０．５－１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．１－０．４ｍｇ／Ｌ中培养；ｆ、伊犁贝母多倍体筛选： 多倍体伊犁贝母的筛选根据二倍体与秋水仙素处理后不定芽在叶片宽度、叶面积、气孔保卫细胞大小及密度确定疑似株，将疑似株转入１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．５－１．０ｍｇ／Ｌ生根培养基中生根；ｇ、伊犁贝母多倍体鉴定：取疑似株幼嫩根尖和幼嫩不定芽组织 ，在４℃下，经过８－羟基喹啉预处理４－６ｈ或饱和对二氯苯水溶液预处理５－１０ｈ或２０％风油精预处理３－７ｈ或０．１％秋水仙素预处理６－８ｈ，卡诺固定液固定１２－１８ｈ，１－２ｍｏｌ／Ｌ盐酸６０℃解离８－１０ｍｉｎ，改良苯酚品红染色液染色５－１０ｍｉｎ，压片观察统计根尖、幼嫩不定芽染色体，确定多倍体植株。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓军，刘传军，郝秀英，赵民安，李晓瑾，努尔波拉提，刘敏，康喜亮，徐琴，
申请(专利权)人：中国科学院新疆理化技术研究所，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]