一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法技术

本发明专利技术提供了一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法，该技术方案从婺源无癌村健康人肠道中分离益生菌，鉴定后评价其耐酸耐胆盐、抗氧化性、抑菌性，并以共培养结合镜检观察的方式筛选出对鼻咽癌细胞具有良好粘附能力的菌株。在此基础上，本发明专利技术将筛选得到的菌株与常规的动物双歧杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌等益生菌进行复配，并限定了含量配比和活菌浓度。本发明专利技术筛选菌株均来自于人体肠道且组配时以双歧杆菌和乳酸菌为主要添加对象，理论上对人体安全、无任何毒副作用；该方法至少添加一株对鼻咽癌患者有明确疗效的双歧杆菌确保了对鼻咽癌治疗的有效性；所用益生菌直接筛选自无癌村健康人群相比其他药物具有价格低廉的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法
本专利技术涉及微生物
，进一步涉及益生菌的生理学应用以及肿瘤的治疗技术，具体涉及一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法。
技术介绍
鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，在我国属高发恶性肿瘤之一，患者自然生存时间平均仅为18.7个月。鼻咽癌的发生与EB病毒感染、环境与饮食、遗传因素以及化学因素密切相关，临床表现为鼻塞、涕中带血、耳闷堵感、听力下降、复视及头痛等。WHO统计表明全世界80％以上的鼻咽癌病例发生在中国，而鼻咽癌在我国南方属高发肿瘤。放射治疗是鼻咽癌治疗的主要手段，对早期患者的治疗效果显著。然而，由于鼻咽部较隐蔽，早期鼻咽癌患者症状不明显，大多数(70％以上)鼻咽癌患者就诊时已属中晚期；此外，鼻咽癌绝大多数属低分化或未分化鳞状细胞癌，恶性程度高，容易出现远处转移，导致晚期鼻咽癌平均5年生存率仍然徘徊在30％～50％，其中局部复发(高达24％～42％)和远处转移(高达37％～48％)是治疗失败的主要原因。最新研究发现，肠道微生物可直接干预各种癌症的发生、发展、治疗和预后。然而由于肿瘤类别多样，微生物的生理学特性也各不相同，因此在针对某种具体肿瘤筛选具有抑制作用的微生物时，仍存在明显的难度。现有技术中，尚未掌握对鼻咽癌具有确切抑制作用的微生物菌群，因此目前仍缺乏一种有效的微生态药物。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法，以解决现有技术的中缺乏一种能针对鼻咽癌具有确切疗效的微生物菌群的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中鼻咽癌的常规治疗方法疗效有待提升。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法，包括以下步骤：1)取中国江西省婺源县赋春镇源头村中，确切不患有癌症的人体的粪便，放入厌氧袋内静置1h，而后从其中取粪便样品加入到内装有灭菌甘油的离心管中，至离心管中粪便样品的重量为甘油重量的10％，密封离心管口离心，而后将离心管存放于-80℃环境中；2)从步骤1)所得离心管中取0.5～1.0g混合物加入试管中，添加无菌玻璃珠对其振荡混匀，而后用无菌水做10倍倍比稀释，从稀释品中取样、利用选择性培养基筛选出植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌株；3)将步骤2)筛选出的植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别接种于液体培养基中，37℃下在CO2培养箱中培养，使其OD值等于0.6时终止培养；4)取HNE-1细胞株在培养瓶中培养，至细胞长满培养瓶后，用1mL浓度为0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液消化2min，而后吹打使细胞脱离培养瓶，用5mLDMEM培养液洗涤细胞，用吸管吹打均匀，得到细胞悬浮液；取六孔细胞培养板每孔加入一个无菌盖玻片以及1mLDMEM培养液，然后向每孔各加入1mL上述细胞悬浮液，将细胞培养板置于37℃、5％浓度的二氧化碳培养箱中培养；当细胞长到盖玻片面积的30％时，分别取步骤3)所得的植物乳杆菌培养液100μL、唾液乳杆菌培养液100μL，各自与2mL培养板中的细胞培养液混合，在37℃细胞培养箱中培养；5)培养l～1.5小时后，用PBS缓冲液清洗5次，甲醇固定，革兰氏染色，油镜观察；依据细菌对HNE-1细胞的粘附能力分别筛选出目的植物乳杆菌和目的唾液乳杆菌；6)取步骤5)所得的目的植物乳杆菌、目的唾液乳杆菌，以及动物双歧杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌分别进行活化培养，当各自的培养液pH为4.2时停止培养；将五种活化的菌液以1:1:1:1:1的体积比混合，将混合液以3000rpm的转速离心10min，取沉淀，向沉淀物中加入与沉淀为等体积的冻干保护剂，冻干；将冻干粉与红薯粉混合，使混合产物中活菌数量为109个/g。作为优选，步骤1)中所述厌氧袋是内充有85％(v/v)N2，5％(v/v)H2，10％(v/v)CO2的塑料袋。作为优选，所述人体的粪便，是其清晨第一次排泄的粪便。作为优选，步骤2)所述的筛选，是先待菌落长出后，以菌落形态、革兰染色初步鉴定目的菌，而后再通过DNA鉴定确定目的菌。作为优选，执行步骤3)前先对步骤2)所得的植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌株分别检测以下指标：菌株耐酸能力，菌株耐胆盐能力，菌株抑制致病菌能力，菌株清除DPPH自由基能力，菌株清除超氧自由基能力，菌株清除羟自由基能力，菌株对Fe2+螯合能力，菌株还原活性。作为优选，所述菌株耐酸能力是通过以下步骤检测的：将活化好的分离菌株以2％的接种量接种到10mL对应培养基中，37℃培养18h，4000rpm转速离心20min，用无菌生理盐水洗涤，收集菌体，将收集到的菌体悬浮于浓度为0.1mol/L的若干无菌磷酸氢二钾溶液中，用乳酸将若干无菌磷酸氢二钾溶液的pH分别调整至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，于37℃培养2h，在0h和2h作10倍梯度稀释，以平板计数法测定活菌数，计算存活率。作为优选，所述菌株耐胆盐能力是通过以下步骤检测的：将活化好的分离菌株以2％的接种量接接种到10mL对应培养基中，37℃培养18h，4000rpm转速离心20min，用无菌生理盐水洗涤，收集菌体，将收集到的菌体悬浮，4000rpm转速离心20min，用无菌生理盐水洗涤，收集菌体，将收集到的菌体悬分别浮于含0.1％、0.3％、0.5％牛胆盐的培养基中，于37℃培养4h，分别在0h和4h测活菌数，计算存活率。作为优选，所述菌株抑制致病菌能力是通过以下步骤检测的：a)将得到的细菌用液体培养基培养1-2d后，8000rpm离心10min，在无菌环境下取出上清液；b)取8株食源性致病菌，分别用LB平板培养基活化后，并用LB液体培养基扩大培养，分别调整其浓度为106CFU/mL，各取200μL涂布于LB平板；c)待菌液吹干后，在平板中放入无菌的牛津杯，向牛津杯中加入步骤a)的细菌培养上清液，37℃培养6-8h；d)测量平板中的抑菌圈直径，并照相。作为优选，步骤6)的活化培养中，目的植物乳杆菌、目的唾液乳杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌所用培养基为MRS培养基；动物双歧杆菌所用培养基为BSM培养基。作为优选，步骤6)所述冻干保护剂含有质量分数为10％的脱脂乳、质量分数为6％的海藻糖、质量分数为2％凝胶。本专利技术提供了一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法，该技术方案从婺源无癌村健康人肠道中分离益生菌，鉴定后评价其耐酸耐胆盐、抗氧化性、抑菌性，并以共培养结合镜检观察的方式筛选出对鼻咽癌细胞具有良好粘附能力的菌株。在此基础上，本专利技术将筛选得到的菌株与常规的动物双歧杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌等益生菌进行复配，并限定了含量配比和活菌浓度。本专利技术筛选菌株均来自于人体肠道且组配时以双歧杆菌和乳酸菌为主要添加对象，理论上对人体安全、无任何毒副作用；该方法至少添加一株对鼻咽癌患者有明确疗效的双歧杆菌确保了对鼻咽癌治疗的有效性；所用益生菌直接筛选自无癌村健康人群相比其他药物具有价格低廉的优点。最新研究表明肠道微生物与肿瘤的发生和发展密切相关，且其在肿瘤放疗化疗、免疫治疗及增敏方面发挥了积极作用，因此本专利技术有助于鼻咽癌的预防和治疗，降低患者死亡率，提高患者的生存率和生存质量。附图说明图1是本专利技术实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)取中国江西省婺源县赋春镇源头村中，确切不患有癌症的人体的粪便，放入厌氧袋内静置1h，而后从其中取粪便样品加入到内装有灭菌甘油的离心管中，至离心管中粪便样品的重量为甘油重量的10％，密封离心管口离心，而后将离心管存放于‑80℃环境中；2)从步骤1)所得离心管中取0.5～1.0g混合物加入试管中，添加无菌玻璃珠对其振荡混匀，而后用无菌水做10倍倍比稀释，从稀释品中取样、利用选择性培养基筛选出植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌株；3)将步骤2)筛选出的植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别接种于液体培养基中，37℃下在CO2培养箱中培养，使其OD值等于0.6时终止培养；4)取HNE‑1细胞株在培养瓶中培养，至细胞长满培养瓶后，用1mL浓度为0.25％的胰蛋白酶‑EDTA溶液消化2min，而后吹打使细胞脱离培养瓶，用5mLDMEM培养液洗涤细胞，用吸管吹打均匀，得到细胞悬浮液；取六孔细胞培养板每孔加入一个无菌盖玻片以及1mL DMEM培养液，然后向每孔各加入1mL上述细胞悬浮液，将细胞培养板置于37℃、5％浓度的二氧化碳培养箱中培养；当细胞长到盖玻片面积的30％时，分别取步骤3)所得的植物乳杆菌培养液100μL、唾液乳杆菌培养液100μL，各自与2mL培养板中的细胞培养液混合，在37℃细胞培养箱中培养；5)培养l～1.5小时后，用PBS缓冲液清洗5次，甲醇固定，革兰氏染色，油镜观察；依据细菌对HNE‑1细胞的粘附能力分别筛选出目的植物乳杆菌和目的唾液乳杆菌；6)取步骤5)所得的目的植物乳杆菌、目的唾液乳杆菌，以及动物双歧杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌分别进行活化培养，当各自的培养液pH为4.2时停止培养；将五种活化的菌液以1:1:1:1:1的体积比混合，将混合液以3000rpm的转速离心10min，取沉淀，向沉淀物中加入与沉淀为等体积的冻干保护剂，冻干；将冻干粉与红薯粉混合，使混合产物中活菌数量为10...

【技术特征摘要】
1.一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)取中国江西省婺源县赋春镇源头村中，确切不患有癌症的人体的粪便，放入厌氧袋内静置1h，而后从其中取粪便样品加入到内装有灭菌甘油的离心管中，至离心管中粪便样品的重量为甘油重量的10％，密封离心管口离心，而后将离心管存放于-80℃环境中；2)从步骤1)所得离心管中取0.5～1.0g混合物加入试管中，添加无菌玻璃珠对其振荡混匀，而后用无菌水做10倍倍比稀释，从稀释品中取样、利用选择性培养基筛选出植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌株；3)将步骤2)筛选出的植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别接种于液体培养基中，37℃下在CO2培养箱中培养，使其OD值等于0.6时终止培养；4)取HNE-1细胞株在培养瓶中培养，至细胞长满培养瓶后，用1mL浓度为0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液消化2min，而后吹打使细胞脱离培养瓶，用5mLDMEM培养液洗涤细胞，用吸管吹打均匀，得到细胞悬浮液；取六孔细胞培养板每孔加入一个无菌盖玻片以及1mLDMEM培养液，然后向每孔各加入1mL上述细胞悬浮液，将细胞培养板置于37℃、5％浓度的二氧化碳培养箱中培养；当细胞长到盖玻片面积的30％时，分别取步骤3)所得的植物乳杆菌培养液100μL、唾液乳杆菌培养液100μL，各自与2mL培养板中的细胞培养液混合，在37℃细胞培养箱中培养；5)培养l～1.5小时后，用PBS缓冲液清洗5次，甲醇固定，革兰氏染色，油镜观察；依据细菌对HNE-1细胞的粘附能力分别筛选出目的植物乳杆菌和目的唾液乳杆菌；6)取步骤5)所得的目的植物乳杆菌、目的唾液乳杆菌，以及动物双歧杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌分别进行活化培养，当各自的培养液pH为4.2时停止培养；将五种活化的菌液以1:1:1:1:1的体积比混合，将混合液以3000rpm的转速离心10min，取沉淀，向沉淀物中加入与沉淀为等体积的冻干保护剂，冻干；将冻干粉与红薯粉混合，使混合产物中活菌数量为109个/g。2.根据权利要求1所述的一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法，其特征在于步骤1)中所述厌氧袋是内充有85％(v/v)N2，5％(v/v)H2，10％(v/v)CO2的塑料袋。3.根据权利要求1所述的一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法，其特征在于所述人体的粪便，是其清晨第一次排泄的粪便。4.根据权利要求1所述的一种辅助治疗鼻咽癌的益生菌微生态药物制备方法，其特征在于步骤2)所述的筛选，是先待菌落长出后，以菌落形态、革兰染色初步鉴定目的菌，而后再通过DNA鉴定确定目的菌。5.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈廷涛，辛洪波，孟凡景，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36