测量酶浓度的方法和装置制造方法及图纸

酶、细菌或其它有关种群浓度的测量方法是利用这些种群使氧化还原剂催化还原．再在电解槽中把还原的氧化还原剂氧化．电解槽使用了一个用不可渗透的绝缘层部分涂覆的，致密的石墨电极．使氧化还原剂再氧化所需要的电量与酶或其它活性种群的浓度有关．（*该技术在2005年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术谈的是测量酶或含酶种群，例如细菌、酵母等，活性成分浓度的方法和装置。一般人们用显微技术或用更复杂的技术，如对含酶液体的光学浊度测量，来计算浓度的。在美国专利3506544中，那时我是个合伙专利技术人，曾介绍过一种用电化学上可逆的氧化还原剂测量酶催化反应中某种成分浓度的技术。把酶，一种氧化还原剂，如亚甲兰，一种基质，如葡萄糖，和一种可配伍的导电性介质，例如缓冲的水溶液在电解槽中混合，通过把电压施加在电极两端，使电流通过电解槽。一般电极是由贵金属制的，酶的活性使氧化的氧化还原剂按酶的浓度相应的比例还原。还原的氧化还原剂在槽的阳极处再氧化，由此产生的槽电流与还原的氧化还原剂的浓度成正比。从而证明电流的增加速率与溶液中酶的浓度成正比。先前测量酶或细菌浓度的各种技术都有某些缺点。有的技术在测量极低浓度时不太灵敏或者很慢，或者需要很多步骤才能测量好。有的相当昂贵，特别是用贵金属或类似物做电极的。此外，还发现在分析个别试样时，有时产生难以解释的误差。在连续使用同一个装置测量多种试样时，先前的技术会出现另一个问题。人们发现把电极从一种试样移到另一种试样中时，第二个槽或试样会被电极所吸附的酶或其它成分污染。同时为了保证槽的填充达到与标定深度相同的、非常精确的测量深度时则需要格外小心，目的是让浸入电解液中的电极表面面积保持恒定。即使极其小心，但在测量时还是发生了难以解释的误差。在试验前需要先使溶液脱氧，这是先前技术存在的另一个问题。人们发现在某些环境中，由于脱氧会有大量的好氧细菌失去活性。另一方面如果溶液不脱氧，则残留的氧会干扰测量精度，因为它会对做为测量依据的阳极处的反应产生影响。按本专利技术做，先前技术中的这样、那样的问题会大大减少或消除。本专利技术提出了一种测量溶液中酶试剂浓度的方法和装置，在溶液中电流在对应电极和一个低孔隙度，长圆柱形、高密度的石墨电极之间通过。石墨电极在溶液中绕自己的纵轴旋转，溶液中还含有氧化还原剂和基质，依靠酶试剂的催化作用进行反应，把氧化还原剂从氧化状态转变成另一状态。通过旋转电极氧化状态的变化影响电流的变化。这种变化与氧化还原剂的氧化状态的变化速率有关，又与酶试剂的浓度有关。除石墨电极的端面外，石墨电极的浸入部分的全部表面被绝缘保护层，如环氧树脂、涂复过。这种绝缘层是不导电的、惰性的，溶液中的成分是不可渗透的。这样可以达到测量精度高、再用性高的目的，使人们可以在连续测试中，通过简单地去掉电极的裸露端，在不同的溶液中用同一个电极对酶试剂做一系列的连续的浓度测量。本方法也提出在测量电流之前对溶液脱气去掉氧。对某些酶试剂而言，如需氧细菌，人们发现在脱气之前把氧化还原剂和基质放入溶液中大大提高了测量精度。在最佳方案中，本专利技术提出用EDTA二钠来提高分析精度。图1是本专利技术测量酶试剂浓度的设备。图2是通过传感电路的电流与时间的图例。图3是溶液测量时反应速率与细菌浓度之间的关系图。图4是沿着图1的4-4线取下的石墨电极的横断面图。图1是盛有溶液12的光化玻璃容器10，溶液中酶试剂的浓度是待测量的，该酶试剂含有一种酶本身，或一种酵母，但本专利技术是专门为含细菌的溶液设计的。溶液12含有水，它是用适宜的缓冲剂，如磷酸二氢钾(KH2PO4)和磷酸氢二钾(K2HPO4)，缓冲到PH7.0的。最佳PH值取决于待测量的特定的酶试剂，但一般中性PH值7.0是适宜的。乙二胺四醋酸二钠盐(EDTA二钠)的加入量要足够使它在溶液12中的浓度达到大约0.01克分子浓度。人们发现它减少了金属离子的干扰，这些金属离子可能以杂质出现在溶液中，它们会影响酶的活性或通过溶液12的电流，以至产生错误的结果。人们认为乙二胺四醋酸二钠与金属离子生成了络合物，阻止了金属离子在测试中的沉淀(沉淀会吸留细菌或待分析的其它酶试剂)。因此乙二胺四醋酸二钠的最佳用量和作用取决于存在的金属离子，这可以用常规实验方法测量。把基质和氧化还原剂加入溶液中，基质和氧化还原剂的类型选择应使它们能受到来自被测的，特定酶试剂的催化作用。对大多数细菌，一般用含大约0.01克分子浓度的葡萄糖和大约0.0001克分子浓度的亚甲兰的溶液12可达到最好的结果。通过容器颈口14、16、18和20可以达到容器10的内部。在放入所有成分后，一种惰性气体，如氩，通过管道30和分配管32，从开孔34以冒泡的形式吹出，向上穿过溶液12。一般用5分钟的时间从溶液12中除去大多数的游离的氧。冒泡的氩和任何挥发性物质，如氧，向上通过蒸汽空间35，并通过出口管36从容器10中除掉。入口管30和出口管36都密封地安装在颈口14的同一个双孔塞38上。另一个含溶液13的玻璃容器通过盐桥100电解连接到容器10的装置上，盐桥含有琼脂和氯化钾。溶液13含有适当的电解液，例如0.1克分子的铁(三价)的EDTA溶液，或氯化钾水溶液。通过颈口15、17和19可以达到容器11的内部。如果需要的话，溶液13也可以脱氧，方法是通过入口管31和分配管33从开口37冒泡，注入惰性气体，如氩，向上穿过溶液13，冒泡的氩和氧以及任何其它挥发性物质向上通过蒸汽空间39，并通过出口管41从容器11中除掉。入口管31和出口管41密封地安装在颈口15的同一个双孔塞43上。电池或直流电源40装有电位计42，电位计带有滑动触头44和电阻器46。滑动触头44通过导体50与对应电极52相连。对应电极52是由一般电极材料制成的。在大多数情况下，人们发现用铁电极是满意的。对应电极52通过塞子54密封地安装在颈口17中。把一个高密度、低孔隙度的石墨电极56，通过塞子57安装在容器10的颈口20上，并通过安培表60和导体62，用导线58连接到电池40的正极上。把一个参比电极70，如饱和的甘汞电极，安装在容器的颈口18的塞子72中，并用导体74和76通过电压表78连接到石墨电极的导体58上。装置在工作时，必须让石墨电极56旋转，以保证电极与溶液12的成分有效地接触，以取代在电极表面被消耗的氧化还原剂，这是用驱动器80和传动器82实现的，如图1所示，可采用很多种转速，但最好的大约100-2000转/分钟的速度旋转电极。可以用低速，但速度太低时，电极会对外部振动更敏感，对低浓度细菌的测量不太灵敏。试验开始时，电位计滑动触头44沿着电阻器46调整直到电压表78的读数是0.0为止。用氩去掉溶液12中溶解的氧之后或同时加入，例如足够的亚铁EDTA去除残余的微量氧，使通过安培表60的测量电流降到0。由安培表60测出的，通过测试电路的电流，如图2所示(即在石墨电极56和对应电极52之间的电流)。一般电流与时间的变化开始是非线性的，短时间之后就成了线性关系了。直线部分的斜率(如图2中切线所示)与电极56处的氧化还原剂的反应速率成正比，原因是酶的催化作用。反应速率和具有葡萄糖和亚甲兰(与细菌量有关)的饱和溶液中的细菌浓度的典型关系用图3表示。在容器10中用300毫升的洪水进行实验，用0.112克的EDTA二钠把它配成0.001克分子的EDTA二钠溶液，向溶液加入1.633克的磷酸二氢钾和3.136克的磷酸氢二钾，使溶液的磷酸盐为0.1克分子。用0.5当量浓度的NaOH和0.5克葡萄糖(0.01M)把PH值调到7，并向溶液中加入15毫升的0.01M亚甲兰(5×10-本文档来自技高网...

【技术保护点】
在测量酶试剂浓度的方法中，第一个电极在第一种溶液中至少是部分浸入的，第二个电极在第二种溶液中也是部分浸入的，第二种溶液与第一种溶液是电解连接的，在第一和第二电极之间施加电压，在两电极之间产生的电流与第一种溶液中的酶试剂的浓度有关，改进之处是采用了孔隙度极低的第一种石墨电极以防止对溶液的大量吸附，约有四分之一英寸的电极浸入液面之下。

【技术特征摘要】
1.在测量酶试剂浓度的方法中，第一个电极在第一种溶液中至少是部分浸入的，第二个电极在第二种溶液中也是部分浸入的，第二种溶液与第一种溶液是电解连接的，在第一和第二电极之间施加电压，在两电极之间产生的电流与第一种溶液中的酶试剂的浓度有关，改进之处是采用了孔隙度极低的第一种石墨电极以防止对溶液的大量吸附，约有四分之一英寸的电极浸入液面之下。2.在发明权利要求1中，石墨电极的孔隙度低于10%。3.在发明权利要求1中，石墨电极是圆柱形的，并绕其纵轴旋转，其转速足以保证电极与第一种溶液成分的有效接触。4.在发明权利要求3中，电极的旋转速度大约在100-2000转/分钟之间。5.在发明权利要求4中，除浸入端面外，圆柱形电极的浸入部分的全部表面都用电绝缘层包复起来，它对第一种溶液是不可渗透的。6.在发明权利要求5中，该圆柱形电极的直径大约在0.1-10厘米之间。7.在发明权利要求6中，该电极直径大约在0.3-1.0厘米之间。8.在发明权利要求1中，该溶液含酶试剂、氧化还原剂和基质，还含有足量的EDTA二钠，以提高对酶试剂浓度的测量精度。9.使电极部分地浸入溶液和对电流做精确测量的方法制备一个圆柱形石墨电极，其直径大约从0.1-10厘米之间，其孔隙度要低于大约10%，用不渗透的聚合物涂复圆柱形电极的表面，把圆柱形电极的端面抛光，使之平滑并产生金属光泽。10.根据权利要求9制备的电极。11.在含酶和溶解了氧的水溶液中测量酶浓度的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：西尔弗曼，
申请(专利权)人：洛尔贝克技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]