一种唾液中皮质醇的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种唾液中皮质醇的检测方法，包括样品的处理、样品的准备、浓缩、稀释、显色和测定步骤，测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后用离心机离心，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤。本发明专利技术通过使用纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜进行过滤处理，利用唾液中的唾液粘蛋白对羟基磷灰石具有高度的亲和力，使液粘蛋白充分粘附在复合微滤膜上，以充分去除唾液中的唾液粘蛋白，避免唾液粘蛋白对唾液皮质醇检测结果的影响，操作简单，检测结果精确，能够提高对人体疲劳状态把控，并根据疲劳状态及时做出应对措施。

【技术实现步骤摘要】
一种唾液中皮质醇的检测方法
本专利技术涉及医学检测
，尤其涉及一种唾液中皮质醇的检测方法。
技术介绍
疲劳,是劳动过程中劳动者由于生理和心理状态的变化，产生某一个或某些器官乃至整个机体力量的自然衰竭状态。疲劳是一种生理现象，也是一种心理现象，从本质上讲是机体的一种正常生理保护机制。从生物医学理论上讲，劳动是能量消耗的过程，这个过程持续到一定程度，中枢神经系统将产生抑制作用，继中枢神经系统疲劳后，就是反射运动神经系统的疲劳，反映出动作的灵敏性降低，作业效率下降。疲劳发生的原因较多，由过多运动、长时间连续工作、精神紧张、睡眠剥夺、视觉疲劳及其它疾病因素导致。疲劳发生后，人体在生理、生化和代谢方面都存在一些共性改变，尤其是在部队军事训练中，疲劳不仅会影响到训练成绩的提高，过度的疲劳还会损害机体的肌肉系统、心血管系统、神经系统、内分泌系统等多种系统，导致食欲降低、体重下降、睡眠障碍等症状。在日常训练中，持续长时间大强度的训练使得机体难以承受，最终对机体造成严重损伤。皮质醇作为应激激素，是疲劳反应的重要指标，血液里的皮质醇约80％与皮质类固醇结合蛋白结合，其余呈游离状态。只有游离的皮质醇才具有生物活性。由于唾液中不含结合蛋白，因此唾液皮质醇能很好地反映血中具有生物活性的游离皮质醇。唾液皮质醇和血液皮质醇具有良好的相关性，且唾液采样不像采血那样给人带来心理压力，因此已广泛应用于疲劳、精神、心理研究。唾液中除了唾液皮质醇，还含有各种有机物与无机物，如唾液粘蛋白等物质，而目前在检测唾液皮质醇前没有对唾液粘蛋白进行处理，或者通过脱脂棉简单的吸附唾液粘蛋白，唾液粘蛋白的去除效果差，影响唾液皮质醇检测结果的准确性。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种唾液中皮质醇的检测方法，使用纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜进行过滤处理，以充分去除唾液中的唾液粘蛋白，提高唾液皮质醇检测结果的准确性。本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)样品的处理：测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后用离心机离心，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤，过滤完成分别用去离子水稀释成0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液；2)样品的准备：取包被板设置样品孔格5个，编号Y0、Y2、Y4、Y8、Y16，用移液枪各自移取0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液50ul分别加入Y0、Y2、Y4、Y8、Y16孔格，并设置空白孔格5个；3)浓缩：用移液枪吸取50ul的酶结合物分别加入样品稀释液的孔格中，用封板膜覆盖所有孔格，充分振荡1min，然后放入37℃的恒温培养箱中培养40～50min，得到浓缩混合液；4)稀释：将3)中得到的浓缩混合液分别倒入烧瓶中，加入35倍体积的去离子水，充分振荡1min，得到稀释混合液，然后分别用稀释混合液加满包被板上的孔格，静置10min后倒回烧瓶，如此重复10次；5)显色：先用移液枪吸取50ul显色剂A液分别加入样品稀释液的孔格中，再用移液枪吸取50ul显色剂B液分别加入样品稀释液的孔格中，充分振荡1min，于20～30℃的条件下显色10min后，在样品稀释液的各个孔格中分别加入50ul的终止液，其中显色剂A液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和过氧化氢的混合溶液，显色剂B液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和硫代硫酸钠；6)测定：以5个空白孔格调零，将包被板放入分光光度计测定样品的吸光度。进一步，步骤3)、步骤4)、步骤5)中所述的振荡均采用超声波振荡，超声波功率为80W，震荡频率为40KHz。进一步，步骤1)中所述唾液离心的条件为：温度5℃～10℃,转速2200r/min～2500r/min,离心时间10min～15min。进一步，步骤6)所述的测定过程中，每隔3min测试一次，连续测试三次，取平均值。进一步，步骤6)中测定样品的检测波波长均为420nm。进一步，1)中所述的经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜的制备方法如下：步骤一，称取聚偏氟乙烯粉末，于60℃下搅拌溶解在N,N-二甲基乙酰胺溶液中，得到聚偏氟乙烯溶液，再取聚偏氟乙烯1％～2％重量的氧化石墨烯加入N,N-二甲基乙酰胺溶液中，超声波分散10h，得到氧化石墨烯溶液，然后将氧化石墨烯溶液加入聚偏氟乙烯溶液，超声波分散10h，得到铸膜液；步骤二，取步骤一中得到的铸膜液于真空条件下脱气1h，然后使用刮膜器在无纺布上平铺200um厚的铸膜液，于空气中停留20s，再将无纺布浸入20℃的去离子水中凝固，然后用去离子水反复冲洗、干燥，得到氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜；步骤三，取纳米羟基磷灰石加入容器中，加入30倍体积的二甲基甲酰胺分散均匀，再加入纳米羟基磷灰石1％重量的浓硫酸，充分搅拌，得到纳米羟基磷灰石分散液；步骤四，取步骤二得到的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜浸入步骤三得到的纳米羟基磷灰石分散液中，加入纳米羟基磷灰石1％～2％重量的TPO-L2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯，用紫外光辐照5min，同时用超声波充分振荡，得到经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜，然后用去离子水反复浸泡洗涤复合微滤膜，真空干燥即可。进一步，步骤三中所述的纳米羟基磷灰石在加入二甲基甲酰胺前，先经过改性处理，改性方法如下：按8:2:0.15的重量比将丙烯酸、对甲苯磺酸和对苯二酚分门加入烧瓶中混合均匀，得到改性混合液，然后取纳米羟基磷灰石加入5倍体积的改性混合液，超声波分散15min，再加热冷凝回流1h后抽滤除去滤液，用去离子水反复冲洗滤渣，烘干即得到改性纳米羟基磷灰石。进一步，步骤三中所述的分散温度为36℃，分散转速为1000r/min～1500r/min。进一步，步骤四中所述真空干燥的条件为：温度35℃～40℃，真空度0.09MPa～0.1MPa。本专利技术的有益效果：本专利技术通过使用纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜进行过滤处理，利用唾液中的唾液粘蛋白对羟基磷灰石具有高度的亲和力，使液粘蛋白充分粘附在复合微滤膜上，以充分去除唾液中的唾液粘蛋白，避免唾液粘蛋白对唾液皮质醇检测结果的影响，操作简单，检测结果精确，能够提高对人体疲劳状态把控，并根据疲劳状态及时做出应对措施。具体实施方式以下将结合实施例对本专利技术进行详细说明：唾液中皮质醇的检测实施例一随机选择年龄的30～35岁生活规律，身体健康的体力劳动者、办公室文员、驾驶员、教师和医生五个不同群体的自愿者，每个群体选择10人，分别于同一天的8:00、12:00、16:00、20:00、24:00五个时间段采集唾液样品，并将样品冷藏于3℃～5℃的环境中；测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后于5℃～10℃,2200r/min～2500r/min的转速下离心10min～15min，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤，过滤完成分别用去离子水稀释成0ng/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)样品的处理：测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后用离心机离心，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤，过滤完成分别用去离子水稀释成0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液；2)样品的准备：取包被板设置样品孔格5个，编号Y0、Y2、Y4、Y8、Y16，用移液枪各自移取0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液50ul分别加入Y0、Y2、Y4、Y8、Y16孔格，并设置空白孔格5个；3)浓缩：用移液枪吸取50ul的酶结合物分别加入样品稀释液的孔格中，用封板膜覆盖所有孔格，充分振荡1min，然后放入37℃的恒温培养箱中培养40～50min，得到浓缩混合液；4)稀释：将3)中得到的浓缩混合液分别倒入烧瓶中，加入35倍体积的去离子水，充分振荡1min，得到稀释混合液，然后分别用稀释混合液加满包被板上的孔格，静置10min后倒回烧瓶，如此重复10次；5)显色：先用移液枪吸取50ul显色剂A液分别加入样品稀释液的孔格中，再用移液枪吸取50ul显色剂B液分别加入样品稀释液的孔格中，充分振荡1min，于20～30℃的条件下显色10min后，在样品稀释液的各个孔格中分别加入50ul的终止液，其中显色剂A液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED‑TA乙二氨四乙酸、ProcLin‑300和过氧化氢的混合溶液，显色剂B液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED‑TA乙二氨四乙酸、ProcLin‑300和硫代硫酸钠；6)测定：以5个空白孔格调零，将包被板放入分光光度计测定样品的吸光度。...

【技术特征摘要】
1.一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)样品的处理：测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后用离心机离心，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤，过滤完成分别用去离子水稀释成0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液；2)样品的准备：取包被板设置样品孔格5个，编号Y0、Y2、Y4、Y8、Y16，用移液枪各自移取0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液50ul分别加入Y0、Y2、Y4、Y8、Y16孔格，并设置空白孔格5个；3)浓缩：用移液枪吸取50ul的酶结合物分别加入样品稀释液的孔格中，用封板膜覆盖所有孔格，充分振荡1min，然后放入37℃的恒温培养箱中培养40～50min，得到浓缩混合液；4)稀释：将3)中得到的浓缩混合液分别倒入烧瓶中，加入35倍体积的去离子水，充分振荡1min，得到稀释混合液，然后分别用稀释混合液加满包被板上的孔格，静置10min后倒回烧瓶，如此重复10次；5)显色：先用移液枪吸取50ul显色剂A液分别加入样品稀释液的孔格中，再用移液枪吸取50ul显色剂B液分别加入样品稀释液的孔格中，充分振荡1min，于20～30℃的条件下显色10min后，在样品稀释液的各个孔格中分别加入50ul的终止液，其中显色剂A液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和过氧化氢的混合溶液，显色剂B液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和硫代硫酸钠；6)测定：以5个空白孔格调零，将包被板放入分光光度计测定样品的吸光度。2.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤3)、步骤4)、步骤5)中所述的振荡均采用超声波振荡，超声波功率为80W，震荡频率为40KHz。3.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤1)中所述唾液离心的条件为：温度5℃～10℃,转速2200r/min～2500r/min,离心时间10min～15min。4.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤6)所述的测定过程中，每隔3min测试一次，连续测试三次，取平均值...

【专利技术属性】
技术研发人员：糜漫天，陈卡，张婷，朱俊东，易龙，朱晓辉，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50