一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码及黄花乌头的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码及黄花乌头的鉴定方法，属于分子鉴定技术领域。通过广泛调查乌头属药用植物分布区，并尽可能的在物种分布区内进行多个地方采样，构建该属药用植物ITS序列的条形码大数据库，然后通过比较发现黄花乌头特有的ITS序列特有信息位点，进一步获得其特有的DNA条形码：所述DNA条形码为由引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增得到的总长为629bp的序列，第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C。利用该DNA条形码将大大有利于药用植物黄花乌头的快速鉴定。

A method for identification of DNA barcodes and Aconitum Aconitum based on large data

The invention discloses a method for identification of yellow flower Aconitum DNA bar code and yellow flower Aconitum based on large data, which belongs to the field of molecular identification technology. Through a survey of Aconitum plants in the distribution of medicinal, and as far as possible in the distribution of species within a local sampling, construction of the medicinal plants of genus ITS sequence code database, then by comparing ITS sequence specific information site rapaics unique, a unique bar code DNA: the DNA bar code by primers of SEQ ID and SEQ NO.1 ID was amplified by NO.2 and the total length of the 629bp sequence, the 89bp A, 443bp A, 447bp A, 491bp and 492bp AT, 499bp T, 577bp C. The use of the DNA bar code will greatly benefit the rapid identification of Aconitum Aconitum in medicinal plants.

【技术实现步骤摘要】
一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码及黄花乌头的鉴定方法
本专利技术涉及分子鉴定
，尤其涉及一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码，及利用该DNA条形码鉴定黄花乌头的方法。
技术介绍
黄花乌头(Aconitumcoreanum(H.Léveillé)Rapaics)，又名关附子、白附子、山喇叭花和黄乌拉花等，为毛莨科乌头属多年生草本药用植物，是吉林省特别是长白山区道地药材。其块根关白附入药，具有祛风、燥湿、化痰止痛之功效。乌头属植物在我国有200余种，同时该属植物均属为有毒植物，乌头类药材使用中同名异物或同物异名的现象普遍存在。国内报道乌头类药中毒屡见不鲜，各种乌头属植物依据传统形态或显微鉴定方法不易辨识。DNA条形码技术(DNABarcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。近几年来，DNA条形码技术已经被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过渡依赖，能帮助鉴定物种、发现新种等。目前，在乌头属药用植物的相关分子鉴定研究中，存在物种鉴定库构建时样品取样不足，未能考虑不同物种间或同一物种内可能存在不同个体间变异位点异同的问题，导致鉴定的可靠性差，准确率低。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码，及利用该DNA条形码鉴定黄花乌头的方法，提高鉴定结果的可靠性和准确率。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码，所述DNA条形码为由引物序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2扩增得到的总长为629bp的序列，第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C。优选的，所述DNA条形码的序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供一种基于大数据DNA条形码的黄花乌头鉴定方法，包括以下步骤：(1)提取待测样本DNA；(2)利用DNA条形码引物进行PCR扩增，得到629bp的扩增产物，所述DNA条形码引物序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；(3)对所述扩增产物进行测序，按照下列特异性位点进行黄花乌头物种鉴别的序列特征比对：第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C；若扩增产物符合上述条件，则该待测样本为黄花乌头。优选的，所述PCR的扩增体系为25μL，组份配比如下：10μmol/L正反向引物各1.0μL，25mmol/L10×PCRbuffer2.5μL，2.5mMdNTP2.5μL，5unit/μLTaqDNA聚合酶0.25μL，50～100ng/L模板DNA1.0μL，ddH2O16.75μL。进一步优选的，所述PCR的扩增条件为：94℃预变性2min，1循环；94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min。优选的，本专利技术所述测序采用双向测序，所述测序的引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。进一步优选的，所述测序的反应体系为5μL：其中ddH2O3μL，10μmol/L正反向引物各0.25μL，测序反应混合物0.5μL，PCR纯化产物1μL。更优选的，所述测序的反应条件为：96℃预变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，33个循环。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术通过广泛调查乌头属药用植物分布区，并在物种分布区内进行多个地方采样，构建该属药用植物ITS序列的条形码大数据库，然后通过比较发现黄花乌头的ITS序列特有信息位点，进一步获得其特有的DNA条形码。相较于以往的形态学或分子鉴定方法，本专利技术是首次在对乌头属药用植物进行广泛取样的基础上，利用ITS序列作为DNA条形码鉴定黄花乌头，通过对ITS序列进行PCR扩增和测序，直接获得鉴定结果，检测过程快速，结果准确性高。该方法将大大有利于药用植物黄花乌头的快速鉴定。附图说明图1为构建乌头属药用植物所用的部分样品的PCR扩增产物图谱，其中，位于右边位置的“M”为GeneRuler100bpPlusDNALadder；图2为乌头属药用植物所用的部分样品比对序列结果。具体实施方式本专利技术通过广泛调查乌头属药用植物分布区，并尽可能的在物种分布区内进行多个地方采样，构建该属药用植物ITS序列的条形码大数据库，然后通过比较发现黄花乌头特有的ITS序列特有信息位点，进一步获得其特有的DNA条形码。本专利技术的黄花乌头DNA条形码为由引物序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2扩增得到的总长为629bp的序列，在该序列中，特异性识别位点为：第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C。本专利技术的扩增引物采用的是ITS序列的通用引物，扩增得到的629bp的序列中，根据上述特异性位点的碱基种类即可鉴定黄花乌头。由于本专利技术的黄花乌头DNA条形码是基于尽可能多获得的乌头属药用植物材料得到的，考虑到了不同物种间或同一物种内可能存在不同个体间变异位点异同的问题，是一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码。采用本专利技术的上述黄花乌头DNA条形码能够快速准确的对黄花乌头进行鉴定，克服了现有技术中鉴定可靠性差的缺陷。本专利技术通过对待测样本的DNA进行提取，通过对扩增产物进行测序，将扩增产物的序列与本专利技术黄花乌头DNA条形码中的特异识别位点进行比对，直接获得鉴定结果。检测过程快速，结果准确性高，可用于药用植物黄花乌头的快速鉴定。本专利技术中，待测样本的DNA提取方法采用本领域技术人员所熟知的方法。在本专利技术具体实施例中，采用改良的4×CTAB法提取待测样本的总DNA。本专利技术对待测样本中DNA来源没有特殊限定，可以为待测样本的叶子、根或茎。本专利技术中PCR扩增及对扩增引物进行测序时所用的序列均为ITS的通用序列，具体为：ITS4(SEQIDNO.1)：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，ITS5(SEQIDNO.2)：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。本专利技术中，PCR扩增方法及对扩增产物进行测序的方法采用本领域技术人员所熟知的方法即可。本专利技术优选采用25μL的PCR扩增体系，组份配比为：10μmol/L正反向引物各1.0μL，25mmol/L10×PCRbuffer2.5μL，2.5mMdNTP2.5μL，5unit/μLTaqDNApolymerase0.25μL，50～100ng/L模板DNA1.0μL，ddH2O16.75μL。本专利技术对扩增体系中的试剂来源没有特殊限定，扩增体系中所用试剂均可采用本领域技术人员所熟知的商用试剂。PCR的扩增条件为：94℃预变性2min，1循环；94℃变性30s，52℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min。上述扩增体系及扩增条件下所有备筛选的样本DNA序列均能成功扩增。本领域技术人员可以在上述技术方案的基础上对扩增体系和扩增条件进行适当合理调整，如改变扩增体系的体积、组分的浓度、调整扩增的温度及时间等，均属于本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码，其特征在于，所述DNA条形码为由引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增得到的总长为629bp的序列，第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C。

【技术特征摘要】
1.一种基于大数据的黄花乌头DNA条形码，其特征在于，所述DNA条形码为由引物序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2扩增得到的总长为629bp的序列，第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C。2.根据权利要求1所述的DNA条形码，其特征在于，所述DNA条形码的序列如SEQIDNO.3所示。3.一种基于大数据DNA条形码的黄花乌头鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样本DNA；(2)利用DNA条形码引物进行PCR扩增，得到629bp的扩增产物，所述DNA条形码引物序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；(3)对所述扩增产物进行测序，按照下列特异性位点进行黄花乌头物种鉴别的序列特征比对：第89bp为A，第443bp为A，第447bp为A，第491bp和第492bp为AT，第499bp为T，第577bp为C；若扩增产物符合上述条件，则该待测样本为黄花乌头。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨俊波，何俊，王家艳，王红，李德铢，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53