一种山羊关节炎‑脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种山羊关节炎‑脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135，包含经优化后的gpP135蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，一致性不小于95%的其它序列；以及包含经优化后的gp135蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示，一致性不小于95%的其它序列。经毕赤酵母GS115表达的gp135诊断标记蛋白反应原性好、便于工业化生产，为开发CAEV高通量血清学诊断方法提供抗原。

A goat serum arthritis encephalitis virus antibody diagnostic marker protein gp135 and preparation method thereof

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a goat serum arthritis encephalitis virus antibody diagnostic marker protein gp135, containing the nucleotide sequence of the optimized gpP135 protein, such as SEQ ID NO.1 shows, other sequence consistency is not less than 95%; and the amino acid sequence contains the optimized gp135 protein such as SEQ, ID NO.2 shows, other sequence consistency of not less than 95%. The gp135 diagnostic marker protein expressed by Pichia pastoris GS115 has good reactivity and is easy for industrial production. It provides antigen for developing CAEV high-throughput serological diagnostic method.

【技术实现步骤摘要】
一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135及其制备方法。
技术介绍
山羊关节炎-脑炎（caprinearthritis-encephalitis，CAE）是由山羊关节炎-脑炎病毒（caprinearthritis-encephalitisvirus，CAEV）引起的山羊的一种慢性病毒性传染病。该病的主要特征是：成年山羊呈缓慢发展的关节炎，间或伴有间质性肺炎和间质性乳房炎；2-6月龄羔羊表现为上行性麻痹的神经症状。本病感染率高，潜伏期长，感染山羊终生带毒，且没有特异的治疗方法，对畜群的生产性能特别是奶产量有重要影响，同时也妨碍了种用动物的正常贸易，被我国列为二类动物疫病，在国际贸易中，相关动物及产品入境时必须检疫。山羊关节炎-脑炎病毒自1982年被Crowford等人发现以来，已经遍布世界许多国家，其中，美国、挪威、英国、日本、墨西哥、巴西等国家尤为严重，血清学调查显示其阳性率超过了30%。我国在1987年从英国进口的萨能奶山羊中分离了山羊关节炎一脑炎病毒并命名为CAEV89-GB1026。目前，主要分布于甘肃、陕西、贵州、山东、黑龙江、辽宁、四川等地区。已经分离鉴定出5个不同的山羊关节炎-脑炎病毒株，分别为甘肃、陕西、四川、贵州和山东毒株，这些毒株的gag-pol基因序列相似在99.2%～99.9%之间，基因型为B1型，与瑞士、斯诺文尼亚等欧洲国家流行株基因型相同。山羊关节炎-脑炎呈地方流行性，发病山羊和隐性带毒者为传染源。可以感染任何年龄、性别的山羊。CAEV感染对宿主具有特异性，山羊是本病的主要易感动物，其中奶山羊最易感，多呈慢性持续感染，潜伏期长，待该病发现时，整个羊群可能已经全部被感染。有国外引种历史的羊群和地区，CAEV感染的风险越高。主要传播途径为羔羊通过吸吮含病毒的初乳和常乳而进行传播，也可以通过易感羊与感染的成年羊长期密切接触而传播。琼脂糖凝胶扩散试验（AGID）是用于检测血清中CAEV抗体的最常用的方法，也是国际兽医组织（OIE）推荐的检测方法。AGID的常用抗原是全病毒抗原，而衣壳蛋白P28和囊膜蛋白gp135也可以用做AGID的抗原，为血清学诊断标记蛋白。同时，由于ELISA更敏感、更经济，且能够用于大规模的血清学筛查，在2004年被OIE定为CAEV检测的标准方法。目前，常用于ELISA抗原包括全病毒抗原和重组抗原，重组抗原中gp135蛋白为重要的血清学诊断标记蛋白。目前gp135蛋白的重组表达方法主要以大肠杆菌表达为代表的原核表达，CAEV病毒感染哺乳动物上皮细胞，利用宿主的蛋白质表达系统进行翻译、表达，而原核细胞的蛋白表达系统与真核细胞差异较大，由于密码子的偏好差异和蛋白结构形成环境的差异使表达得到的蛋白在氨基酸序列、二级和三级结构上存在较大差异；此外，大肠杆菌表达已形成包涵体，不利于工业化生产。
技术实现思路
专利技术目的：本申请以GeneBank中公开的CAEV病毒遗传物质DNA序列为基础，根据毕赤酵母GS115表达蛋白中密码子的偏好、优化表达蛋白的稳定性、形成分泌表达等方面对gp135蛋白的编码基因进行优化并合成，将合成的基因克隆入pPIC9K质粒构建重组质粒，并将线性化的重组质粒电激转化入毕赤酵母GS115中，筛选表达gp135蛋白的单克隆菌落，经诱导表达确定为分泌表达，且与CAEV感染靶标动物刺激产生的抗体产生抗原-抗体反应。本专利技术技术方案如下：一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135，包含经优化后的gpP135蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO.1所示，一致性不小于95%的其它序列；以及包含经优化后的gp135蛋白的氨基酸序列，如SEQIDNO.2所示，一致性不小于95%的其它序列。进一步，仅为优化后的gpP135蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO.1所示，优化后的gpP135蛋白的氨基酸序列，如SEQIDNO.2所示。一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135的制备方法，包括下述步骤：（1）gp135基因的密码子优化及合成用毕赤酵母GS115表达蛋白中的密码子对CAEVgp135蛋白的编码基因进行优化及合成，获得pUC57-gp135质粒；（2）重组载体的构建将上述pUC57-gp135质粒经NotⅠ和EcoRⅠ双酶切后与pPIC9K连接，构建重组表达质粒pPIC9K-gp135；（3）毕赤酵母GS115阳性重组子的筛选通过电激转化将线性化的重组表达质粒pPIC9K-gp135导入毕赤酵母GS115中；（4）gp135/GS115工程菌的诱导表达，获得gp135蛋白。有益效果：用该方法制备的CAEV血清学诊断标记蛋白gp135反应原性好、便于工业化生产，为开发CAEV高通量血清学诊断方法提供抗原。附图说明附图1为CAEVGP135基因序列的同源性和遗传偏离分析；附图2为优化后的GP135基因序列（5’-3’）及蛋白质氨基酸序列（C-N）；附图3为pPIC9K-GP135重组质粒的双酶切鉴定结果，其中1：pPIC9K-gp135NotⅠ和EcoRⅠ双酶切结果；2：pPIC9KNotⅠ和EcoRⅠ双酶切结果；3：空白对照；4：markerD（生工）；附图4为线性化pPIC9K-GP135转化GS115结果；附图5为GP135/GS115菌株PCR鉴定结果，其中，M：markerD（生工）；2、5、9-17，20-23：PCR阳性结果，24：阴性对照；其它为阴性结果；附图6；附图7为GP135蛋白表达与定量；其中，1-2：GP135/GS115工程菌诱导培养上清（20倍浓缩）；M蛋白分子量marker（低）（TAKARA）；附图8为WB方法诊断CAEV感染羊结果；其中，M：预染蛋白Marker；1：阴性血清样本；2、3：CAEV感染山羊阳性血清样本；附图9为AGID方法诊断CAEV感染羊结果；其中，左、右两幅图中：左-1、右-3为CAEV感染山羊阳性血清样本；左-3和左-4、右-1和右-2为CAEV阴性血清样本；左-2、右-4为空白对照。具体实施方式实施例1、CAEVgp135基因的优化与合成（1）CAEVgp135基因的同源性分析对GeneBank中公开的属于我国分离的三株山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）（GeneBank：KT749879.1,KT749880.1，KT749881.1）编码gp135蛋白的基因进行同源性分析。经序列比对分析表明，三株CAEV编码的gp135基因序列差异较小，同源性在99.2%以上，与国际上公开的基因序列的同源性大于78%，见图1。（2）CAEVgp135基因的密码子优化根据毕赤酵母GS115表达蛋白中密码子的偏好、诱导表达蛋白的稳定性、糖基化、形成分泌表达等方面对gp135蛋白的编码基因进行优化，委托上海生物工程技术有限公司合成部进行全基因合成，最终获得了pUC57-gp135质粒，优化后的编码gp135蛋白基因的序列（5’-3’）及表达蛋白的氨基酸序列（C-N），见图2。2.重组载体的构建将pUC57-gp135质粒经NotⅠ和EcoRⅠ双酶切后与pPIC9K连接，构建了重组表达质粒p本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种山羊关节炎‑脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135，其特征在于：包含经优化后的gpP135蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，一致性不小于95%的其它序列；以及包含经优化后的gp135蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示，一致性不小于95%的其它序列。

【技术特征摘要】
1.一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白gp135，其特征在于：包含经优化后的gpP135蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO.1所示，一致性不小于95%的其它序列；以及包含经优化后的gp135蛋白的氨基酸序列，如SEQIDNO.2所示，一致性不小于95%的其它序列。2.如权利要求1所述的一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标记蛋白GP135，其特征在于：优化后的gpP135蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNO.1所示，优化后的gpP135蛋白的氨基酸序列，如SEQIDNO.2所示。3.一种山羊关节炎-脑炎病毒血清抗体诊断标...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建勇，王登峰，李建军，古努尔·吐尔逊，刘志强，杨学云，金映红，刘艳丰，班万里，王文奇，马晓菁，叶锋，刘丽娅，蒋晓梅，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：新疆,65