用于色谱的方法技术

本发明专利技术涉及色谱领域。更贴切地说，本发明专利技术涉及用于纯化血浆蛋白(例如VIII因子、血管性血友病因子和IX因子)的色谱方法。所述色谱方法在包含内部多孔芯和围绕所述芯的外部多孔盖的基质上进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于色谱的方法专利
本专利技术涉及色谱领域。更贴切说，本专利技术涉及用于纯化血浆蛋白(例如VIII因子、血管性血友病因子(vonWillebrandfactor)和IX因子)的色谱方法。所述色谱方法在包含内部多孔芯和围绕所述芯的外部多孔盖的基质上进行。专利技术背景血液包含不同类型的细胞和分子，这些细胞和分子对于重要的身体功能是必需的，因此被收集用于治疗目的，例如用于输血。然而，可以从血液分离并制备不同的级分，例如血液红细胞或无细胞血浆，这使得能够对医学病症进行更有针对性的治疗处理。血浆中的若干蛋白也可以被进一步分离并用于特异性治疗处理，例如白蛋白用于恢复血液体积，免疫球蛋白用于免疫缺陷，凝血因子用于凝血障碍。血浆包含不同功能、不同大小、不同量等的蛋白，因此对于不同血浆蛋白的纯化有不同的方法。纯化方法通常设计为从一个单一的血浆原料池获得若干目标蛋白。所述方法通常涉及沉淀或色谱步骤或其组合。色谱法通常用于提高目标蛋白的纯度并降低有害副作用的风险。许多血浆蛋白表现出非常有效的活性，如果作为污染物存在，在给予患者时即使在非常低的水平下它们也会导致不良反应。收集的人血浆被冷冻储存，血浆蛋白纯化方法中的初始步骤是解冻和汇集血浆。当在低温(通常为1-6℃)下解冻时，某些血浆蛋白发生沉淀并可以例如通过离心收集。收集的沉淀物称为冷沉淀物且可用作凝血因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的来源。血浆中的大部分FVIII作为与大vWF多聚体的复合物存在，因此这两种蛋白通常被共同纯化。去除冷沉淀物后的剩余液体通常被称为冷贫化血浆或冷上清液，并且其可以用作例如白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、凝血因子IX(FIX)的来源。许多血浆蛋白的纯化可能是挑战性的。这可能取决于少量具有不期望但有效活性的污染物的存在，或者蛋白有时失去其活性或获得不需要的活性。例如，FVIII容易失去活性，用于纯化的已知方法在许多方面不令人满意。因此，需要可以在蛋白保持其活性的条件下操作的改进方法，以便以良好的产率获得血浆产物。专利技术概述本专利技术提供用于纯化血浆蛋白(特别是用于人血浆应用的血浆蛋白)的色谱材料和方法。色谱材料能够基于不同原理进行分离，例如尺寸和结合/洗脱。本专利技术的方法特别适用于包含受治疗关注的大蛋白(例如FVIII/vWF)和较小蛋白质(HAS、IgG、FIX)二者的血浆样品的纯化。因此，本专利技术提供一种用于从血浆纯化治疗性蛋白的色谱方法，包括以下步骤：将血浆加载在填充有包含具有内部多孔芯和外部多孔壳的多孔壳珠粒的树脂的色谱柱上，其中所述内部芯提供有阴离子交换配体，并且所述壳是失活的(即未提供有任何配体)，并且其中所述盖和芯的孔隙率不允许大于500kD的分子例如FIII/vWF进入；将IX因子(FIX)吸附在芯中的阴离子交换配体上；收集流通物中的分离的血浆蛋白；并从芯中的配体洗脱FIX。色谱法中运行和洗脱缓冲液的调整在本领域技术人员的知识范围内，其实例在下面的实验部分中描述。阴离子交换配体可以是任何阴离子交换配体，但优选选自二乙基氨基乙基(DEAE)、季型氨基乙基(QAE)或季铵(Q)，最优选阴离子交换配体是Q-配体。在一个优选实施方案中，除了FIX之外还将其它血浆蛋白通过芯和壳的筛选作用彼此分离而收集在流通物中，并且包含VIII因子(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)、IgG、人血清白蛋白(HSA)和补体C3。参见下图1B中的色谱图，该图描述了峰A、B和C。在一个替代的实施方案中，血浆的加载重复1-20次、优选5-10次，随后在将FIX从芯中的配体洗脱之前，运行缓冲液以获得相应数目的流通物(FT's)。每次加载之后运行约1柱体积的缓冲液并且获得作为加载数的相应的FT数。这在下图1A-1B中更详细地描述。在该替代实施方案中，汇集相应FT的特定级分以分别获得FVII/vWF、IgG/HSA和C3。因此，在一个且相同的色谱柱上，获得针对FVIII/vWF、IgG/HAS、C3和FIX的分离的血浆级分。优选地，总壳珠粒(即壳+芯)厚度为直径40-100µm，盖厚优选为2-10μm。芯中的配体浓度优选为50-200μmol/ml。在另一个实施方案中，壳提供有亲和配体、疏水相互作用配体、IMAC配体、阳离子交换配体或多模配体(或者依赖于非阴离子交换配体的另一种分离原理的任何配体)；且其它非FIX血浆蛋白(如FVIII/Vwf、IgG、HAS、C3)在与FIX吸附在芯中的配体上的同一步骤中吸附在壳中的配体上；并且其中血浆蛋白从壳中的配体(FVIII/vWF和/或IgG、HAS、C3，取决于所选择的配体类型)和芯中的配体(FIX)依次洗脱。优选地，壳中的配体是具有免疫球蛋白亲和力的配体，例如蛋白A或G或其本领域已知的变体。用于本专利技术方法中的多孔材料优选是筛选材料，例如通常用于色谱的凝胶过滤材料。内部芯中的多孔材料可以具有与盖中的多孔材料相同或不同的孔隙率。多孔材料衍生自合成聚合物材料，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯和乙烯基酰胺，或衍生自天然聚合物材料，例如选自琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、魔芋、角叉菜胶、结冷胶和藻酸盐的糖类。优选的多孔材料是琼脂糖。壳和芯可以由相同孔隙率的琼脂糖制成，但它们也可以由不同的孔隙率的琼脂糖制成。在第二方面，本专利技术涉及从上述方法获得的血浆蛋白用于治疗的用途。例如白蛋白用于恢复血体积，免疫球蛋白用于免疫缺陷，凝血因子用于凝血障碍。预期血浆蛋白特别是FIX可无需进一步纯化去除污染物而用于治疗，但需要调整生物相容性等。附图简述图1A：施加于原型99柱的血浆的色谱图。数字1-6=来自6次样品施用的流通物(FT)峰；E=洗脱峰；CIP=原位清洁。吸光度280nm-实线；电导率-点线；pH-短划线。图1B：根据图1A的施加于原型99柱的血浆的色谱图的局部放大，显示最终(第6次)样品施加和洗脱。6=来自第六次样品施加的流通物峰；A=大分子，例如FVIII/vWF；B=较小的分子，例如白蛋白、IgG；C=部分保留的材料；E=洗脱的分子，例如FIX。吸光度280nm-实线；电导率-点线；pH-短划线。专利技术详述现在将结合一些非限制性实施例和附图来更详细地描述本专利技术。实施例1：原型的合成通述基质体积是指沉降床体积，且以克为单位的基质重量是指抽吸干重。对于大规模的反应，搅拌是指悬着的电机驱动的搅拌器，原因是使用磁力棒搅拌器促进损坏珠粒。使用常规方法分析功能性和确定烯丙基化程度或珠粒上配体含量的程度。载体颗粒所使用的载体颗粒是高度交联的琼脂糖珠粒，该琼脂糖珠粒按照美国专利6,602,990中描述的方法制备，该专利的全部内容通过引用并入本文。珠粒具有88微米的体积加权平均直径(D50，v)和孔径分布使得Mw为110kDa的葡聚糖分子可到达69％的孔体积。这也可以表示为使得当根据在"HandbookofProcessChromatography,AGuidetoOptimization,Scale-Upandvalidation"(1997)AcademicPress,SanDiego.GailSofer&LarsHagel编辑，ISBN0-12-654266-X，第36本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从血浆纯化治疗性蛋白的色谱方法，包括以下步骤：将血浆加载在填充有包含具有内部多孔芯和外部多孔盖的多孔盖珠粒的树脂的色谱柱上，其中所述内部芯提供有阴离子交换配体，并且其中所述盖和芯的孔隙率不允许大于500kD的分子进入；将IX因子(FIX)吸附在芯中的阴离子交换配体上；收集流通物中的分离的血浆蛋白；并从芯中的配体洗脱FIX。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.10 GB 1506117.91.一种用于从血浆纯化治疗性蛋白的色谱方法，包括以下步骤：将血浆加载在填充有包含具有内部多孔芯和外部多孔盖的多孔盖珠粒的树脂的色谱柱上，其中所述内部芯提供有阴离子交换配体，并且其中所述盖和芯的孔隙率不允许大于500kD的分子进入；将IX因子(FIX)吸附在芯中的阴离子交换配体上；收集流通物中的分离的血浆蛋白；并从芯中的配体洗脱FIX。2.根据权利要求1的方法，其中所述阴离子交换配体选自二乙基氨基乙基(DEAE)、季型氨基乙基(QAE)或季铵(Q)。3.根据权利要求2的方法，其中所述阴离子交换配体是Q-配体。4.根据权利要求1、2或3的方法，其中除了FIX之外还有其它血浆蛋白通过芯和壳的筛选作用彼此分离被收集在流通物中，并且包含VIII因子(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)、IgG、人血清白蛋白(HSA)和补体C3。5.根据上述权利要求中一项或多项的方法，其中血浆的加载重复1-20次、优选5-10次，随后在将FIX从芯中的配体洗脱之前，运行缓冲液以获得相应数目的流通物(FT's)。6.根据权利要求5的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：M霍尔，K布森，JL马罗瓦塞尔，H斯科拉，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞典,SE