一种用于活动性结核诊断的蛋白芯片及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于活动性结核诊断的蛋白芯片及试剂盒。蛋白芯片上含有针对29种蛋白的特异性抗体。所述蛋白芯片能特异性地将活动性结核病人与健康人群、非结核性肺炎病人和治愈后的结核病人区分开来，并且具有较高的灵敏性和特异性、高通量、标本用量少、便于普通实验室推广和规模化；同时在临床诊断上的应用有利于更快更准确的发现活动性结核病人，有望用于活动性结核的筛查诊断及活动性结核的确诊，健康人群的体检，结核治疗疗效的预测评估等，为结核病的疫情的控制提供强有力的技术支持。

A protein chip and kit for the diagnosis of active tuberculosis

The invention discloses a protein chip and a kit for the diagnosis of active tuberculosis. The protein chip contains specific antibodies against 29 proteins. The protein chip can specifically be active tuberculosis patients and healthy people, non tuberculous pneumonia patients and after the cure of tuberculosis patients to distinguish, and it has high sensitivity and specificity, high throughput and less amount of sample and easy promotion and common laboratory scale; and the application in clinical diagnosis is beneficial to faster and more accurate discovery of active tuberculosis, tuberculosis screening and diagnosis is expected for the activity of the active tuberculosis diagnosis, health examination, clinical tuberculosis treatment evaluation, and provides strong technical support for TB epidemic control.

【技术实现步骤摘要】
一种用于活动性结核诊断的蛋白芯片及试剂盒
本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种用于活动性结核诊断的蛋白芯片试剂盒。
技术介绍
2015年世界卫生组织数据表明，结核病是继艾滋病之后由单一病原体引起的死亡人数最多的传染病。如何降低结核病疫情是我市经济和社会发展面临的重大课题。造成结核病疫情严重主要的原因之一是缺乏有效的早期诊断技术。结核病诊断技术来说，一个多世纪过去了，我们今天在临床上依然在沿用最早的结核病诊断技术：结核菌涂片和结核菌培养。虽然操作简单，价格经济，但涂片的敏感性不超过30％；培养的敏感性不超过40％，而且因为是菌种鉴定和药敏试验的基础，一直是诊断结核病的金标准，但其需要耗时1-2个月，很多病人已经开始治疗2个月，甚至更长时间，才能获得结核菌培养结果。结核菌分子生物学诊断试剂，尤其是geneXpert的研发，为结核病诊断提供重要的新技术。然而，临床上相当多的活动性结核患者没有痰标本。因此，采用基于痰标本的病原学诊断技术，即便所有的技术都采用，敏感性也不会超过50％。换句话说，有超过50％的患者，找不到结核病诊断的病原学依据。结核病诊断方法的不理想其中较突出的问题是由于缺乏特异性的标识。目前许多研究团队致力于在宿主方面寻找新的突破，其中包括寻找新的生物标识，用于活动性结核的诊断。新近的蛋白质芯片技术因具有更高灵敏度，能同时检测多达几百，甚至上千种目标蛋白或多肽，目前广泛应用于分子生物学领域和临床检测上，如在个体化治疗、药物开发、疾病诊断、预后检测等领域的研究，在肿瘤、心血管系统疾病、神经病学疾病等疾病研究中应用。然而，利用蛋白芯片筛选结核病特异性的分子标志用于诊断或治疗等研究，目前还没有相关的报导。
技术实现思路
针对现有结核病疫情的严重性及对现有诊断性技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种高灵敏度、高特异性的用于活动性结核病诊断的蛋白芯片试剂盒。为实现上述目的，本专利技术一种用于活动性结核诊断的蛋白芯片，所述蛋白芯片上含有针对如下蛋白的特异性抗体：整合素样金属蛋白酶与凝血酶8、碳水化合物磺基转移酶4、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E/M、叶酸受体2、粒细胞集落刺激生物因子、透明质酸蛋白聚糖连结蛋白1、干扰素α/β受体2、胰岛素样生长因子结合蛋白5、白细胞介素-1R6、白细胞介素-11、白细胞介素-12p40、白细胞介素-21R、白细胞介素-23、白细胞介素-29、白细胞介素-7、激肽释放酶14、淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1、基质金属蛋白酶、髓性造血细胞抑制因子、血小板衍生生长因子AB、血小板衍生生长因子BB、白细胞介素-1受体4、组织因子途径抑制因子、肿瘤坏死因子b1、血浆血栓调节蛋白、组织金属蛋白酶抑制剂-2、肿瘤坏死因子b、胸腺基质淋巴细胞生成素。本专利技术所述用于活动性结核诊断的蛋白芯片，按此步骤制备得到：将含0.02-2ng的权利要求1所述特异性抗体的PBS缓冲液100-1000pl和两种不同浓度的阳性对照用全自动点样仪点样于玻片上；每种抗体和两种不同浓度的阳性对照在每个芯片中都有4次的重复；将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干燥2小时；干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区；用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装后于2℃到8℃保存备用即可，所述PBS缓冲液为含有0.01-10g/100ml牛白蛋白的PBS溶液；所述阳性对照为生物素标记的牛IgG。本专利技术所述一种用于活动性结核诊断的蛋白芯片试剂盒，含有上述的蛋白芯片。在实际操作中，将冻干的标准品混合物复溶后经梯度稀释制备成系列不同蛋白标志物浓度的混合液，用来制作多重夹心ELISA方法的标准曲线。将冻干的多肽刺激物复溶后按比例稀释成特定浓度的混合液，用来作为样本的特异性刺激。本专利技术所述的试剂盒能够检测29个常用的蛋白，能特异性地将活动性结核病人与健康人群、非结核性肺炎病人和治愈后的结核病人区分开来，并且具有较高的灵敏性和特异性、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。本专利技术在临床诊断上的应用有利于更快更准确的发现活动性结核病人，有望用于活动性结核的筛查诊断及活动性结核的确诊，健康人群的体检，结核治疗疗效的预测评估等。本专利技术利用蛋白芯片筛选了一系列在结核病人上特异性地表达的蛋白，并且将筛选出蛋白组合成小芯片，用于结核病的诊断。本专利技术优越于其它能同时检测多个蛋白质的技术，需求标本量极低，在分辨活动性结核病人和非活动性结核人群(健康对照、非结核性肺炎病人和治愈后结核病人)实现较好的敏感性和特异性的优点。为结核病的早期诊断和早期治疗提供新的方法。本专利技术所述的蛋白芯片试剂盒通过类似于夹心法ELISA的检测方法，用含Cy3通道的激光扫描仪对反应结束的玻片进行扫描成像，选用合适的激光扫描参数使芯片上最高信号接近饱和，所得图像存储为tiff文件。然后用芯片读数软件将每个点的荧光信号转化为数码信号。通过梯度稀释的蛋白标志物的标准样品的数码信号绘制每个蛋白标志物的信号与浓度标准曲线，然后通过相应的标准曲线计算出每个蛋白在未知样品中的浓度。本专利技术所述的蛋白芯片应用所检测的样本为经结核特异性多肽混合物刺激后的培养上清。多肽混合物为多肽序列来源于CFP-10和ESAT-6蛋白序列合成的多肽片段按等量混合。收集的全血标本加入培养基和特异性多肽混合物(10ug/ml)，充分混匀后，放入36℃二氧化碳孵箱中培养，培养16小时后，2000转/分离心5分钟，抽取上清。本专利技术所述的用于活动性结核诊断的蛋白芯片试剂盒，具有以下特点和优点:(1)在芯片的组成上，本专利技术采用活性环氧基团包被的标准组织玻片，实验表明，活性环氧基团包被的玻片可以更有效地吸附包被抗体在芯片的表面，并且使抗体的稳定性增加。(2)在芯片点样前采用特定的框架结构，优化了芯片点阵，使得样本可批量检测，操作简便，样本用量小，互不交叉污染。(3)在芯片的制备工艺上，控制温度为70-75F，湿度为40-45％，这样的芯片可以改善点样的形态，使抗体在玻片上的分布更加均匀。同时，室温的过夜静置有利于抗体更有效地固定在玻片上。除此以外，真空抽气干燥2小时并用抗水蒸气的塑料小袋抽气密封并于4℃保存。实验表明，用这种方法所保存的芯片使得抗体更有效地固定在芯片表面，并有效地增加芯片保存的稳定性。(4)在芯片微阵列的点阵上，本专利技术采用不同浓度的双阳性对照，并考虑同时使用两者的不同强度信号来标准化不同的微阵列。实验表明，本专利技术可以明显地改善芯片的敏感度和重复性。(5)为实现试剂盒在诊断活动性结核的特异性，本专利技术加入结核特异性多肽混合物处理样本，蛋白芯片检测的样本为经特异性多肽的刺激后的血浆中不同的蛋白成分。实验表明，本专利技术能把活动性结核病人与健康人群、非结核性肺炎病人和治愈后的结核病人区分开来，并且具有较高的灵敏性和特异性。采用本专利技术的活动性结核诊断蛋白芯片试剂盒，本专利技术所述的试剂盒能够检测29个常用的蛋白，能特异性地将活动性结核病人与健康人群、非结核性肺炎病人和治愈后的结核病人区分开来，并且具有较高的灵敏性和特异性、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。本专利技术在临床诊断上的应用有利于更快更准确的发现活动性结核病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于活动性结核诊断的蛋白芯片，其特征在于，蛋白芯片上含有针对如下蛋白的特异性抗体：整合素样金属蛋白酶与凝血酶8、碳水化合物磺基转移酶4、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E/M、叶酸受体2、粒细胞集落刺激生物因子、透明质酸蛋白聚糖连结蛋白1、干扰素α/β受体2、胰岛素样生长因子结合蛋白5、白细胞介素‑1R6、白细胞介素‑11、白细胞介素‑12p40、白细胞介素‑21R、白细胞介素‑23、白细胞介素‑29、白细胞介素‑7、激肽释放酶14、淋巴管内皮细胞透明质酸受体‑1、基质金属蛋白酶、髓性造血细胞抑制因子、血小板衍生生长因子AB、血小板衍生生长因子BB、白细胞介素‑1受体4、组织因子途径抑制因子、肿瘤坏死因子b1、血浆血栓调节蛋白、组织金属蛋白酶抑制剂‑2、肿瘤坏死因子b、胸腺基质淋巴细胞生成素。

【技术特征摘要】
1.一种用于活动性结核诊断的蛋白芯片，其特征在于，蛋白芯片上含有针对如下蛋白的特异性抗体：整合素样金属蛋白酶与凝血酶8、碳水化合物磺基转移酶4、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E/M、叶酸受体2、粒细胞集落刺激生物因子、透明质酸蛋白聚糖连结蛋白1、干扰素α/β受体2、胰岛素样生长因子结合蛋白5、白细胞介素-1R6、白细胞介素-11、白细胞介素-12p40、白细胞介素-21R、白细胞介素-23、白细胞介素-29、白细胞介素-7、激肽释放酶14、淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1、基质金属蛋白酶、髓性造血细胞抑制因子、血小板衍生生长因子AB、血小板衍生生长因子BB、白细胞介素-1受体4、组织因子途径抑制因子、肿瘤坏死因子b1、血浆血栓调节蛋白、组织金属蛋白酶抑制剂-2、肿瘤坏死因子b...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，刘小山，黄若磐，
申请(专利权)人：深圳市星系生物科技有限公司，广州瑞博奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44