金花葵核苷类物质的发现及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于自然活性物质的发现与健康产品、药物研究开发领域，涉及金花葵核苷类物质的发现及其制备方法与应用。由金花葵或同属植物及其化学关联植物，经水或乙醇提取；醇沉除杂；大孔吸附树脂富集；萃取纯化等方法制备，得到不同核苷含量的金花葵系列制备物(包括提取物、醇沉物、富集物和纯化物等)。本发明专利技术中金花葵系列制备物均具有多种不同的药理活性、特别是抗肿瘤活性，可单用，或组合复方应用，或作为添加物应用于多种药物与健康功能性物质及其制品等的开发之中。

【技术实现步骤摘要】
金花葵核苷类物质的发现及其制备方法与应用
本专利技术属于自然活性物质的发现与健康产品、药物研究开发领域，具体涉及金花葵核苷类活性物质的发现及其制备方法与应用。
技术介绍
金花葵为锦葵科秋葵属植物，含有多种生物活性物质，文献报道金花葵中含有黄酮类成分、多糖、不饱和脂肪酸、维生素E及多种微量元素等。申请人通过研究发现金花葵含有核苷类成分，该类成分是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，参与DNA代谢过程，具有很好的药理活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗心肌缺血、抗凝血、抗炎、免疫调节、改善心脑血管循环、防治心律失常等作用，有较高的保健与药用价值。本专利技术采用溶剂提取法、色谱法富集和溶剂萃取法纯化等方法对核苷类成分进行制备，功效考察结果表明所制备的不同核苷类成分含量的系列制备物具有多种不同的药理活性，特别是抗肿瘤活性，可用于健康产品和药物的研发。
技术实现思路
本专利技术的目的在于金花葵核苷类物质的发现，本专利技术的另一个目的在于提供其制备方法，本专利技术的第三个目的在于提供其质量控制方法，本专利技术的第四个目的在于提供金花葵系列制备物(包括提取物、醇沉物、富集物和纯化物等)在单方制品、组方制品、或作为添加物等在药品、保健品、食品等方面的应用。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：金花葵核苷类物质，主要活性成分为核苷类成分，如胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷等成分，可由化学合成、制备，自然资源提取制备而成。本专利技术中的金花葵核苷类物质可通过含有类似物质的植物及其代用品，包括其植物各个部位，单独或组合制成。如下组，但不限于：组1金花葵/菜芙蓉、野芙蓉、黏干、山榆皮等同属植物本专利技术金花葵系列制备物的制备方法分为如下步骤：步骤1：以金花葵或金花葵同属植物原植物作为原料；步骤2：用水或有机溶剂提取，减压回收溶剂；步骤3：加醇，沉淀除杂；步骤4：富集；步骤5：萃取纯化。该金花葵系列制备物中核苷指标性成分加和含量为1％～100％(质量百分比)，该金花葵系列制备物中核苷指标性成分加和含量优选为5％～100％(质量百分比)。上述步骤1中，选取金花葵(菜芙蓉、野芙蓉、黏干、山榆皮)同属植物原植物(包括金花葵的各部位)及其加工品，对于金花葵以及金花葵同属植物原植物的选择部位没有特殊限制，可以整体作为原料，也可以选取植物中的一部分作为原料，如花、茎、根、叶等组合或者单独作为原料，优选为金花葵花。上述步骤2中，金花葵原料用水或5％～90％乙醇回流提取1～5次，每次提取10～90min，合并提取液，减压回收溶剂至干，制得金花葵提取物。采取上述步骤2的技术方案的有益效果为：提高有效成分的提取率。上述步骤3中，将步骤2中所得药液减压回收溶剂至浓度(以生药量计)为0.05～1.5kg/L，加入1～8倍量的95％乙醇，充分搅拌，静置过夜，2000～8000r/min离心5～30min，取上清液，减压回收溶剂至干，制得金花葵醇沉物。上述步骤4中，将步骤3所得金花葵醇沉物加水分散溶解，使水溶液浓度为0.01～0.80kg/L，水溶液通过大孔吸附树脂，吸附流速为0.2～10BV/h，树脂柱径高比为1∶(2～15)，上样量与树脂体积比为0.01～0.50kg/L，水洗脱0～8BV，洗脱流速为0.2～10BV/h，0％～50％乙醇洗脱1～30BV，洗脱流速为0.2～10BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得金花葵富集物。上述步骤5中，将步骤4所得的金花葵富集物加少量水完全溶解，使浓度为0.1～0.5kg/L，加入2％氢氧化钠溶液调pH为8～11，再加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取2～8次，静置，合并正丁醇层，回收溶剂，减压干燥，即得金花葵核苷纯化物。将以上所得的任何形式的制备物，特别是其纯化物，加入常规辅料，食料，香料，调料等，或作为添加物制备任意常规食品形式，或药剂学可接受的任意常规剂型，包括胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、靶向制剂、缓释剂、口服液等，也可应用于单方制品、复方制品、制备物以及健康功能食品、自然健康产品及其调料与药物药品等开发中。对于金花葵系列制备物，可通过自然资源提取制备，可以通过化学合成或结构修饰以及生物合成或生物转化等途径获得。本专利技术金花葵系列制备物为金花葵原料经水、乙醇或其他有机试剂提取；通过一定倍量的乙醇沉淀除杂；再通过大孔树脂吸附或其他色谱方法，如聚酰胺色谱法等；或溶剂法，如溶剂萃取法等纯化得到；经功效实验表明具有多种药理作用，不同核苷类成分含量的金花葵系列制备物均可与其他单方、制备物或复方等药物配伍组合使用，制成可接受的任意常规制品，在多种药物和产品中广泛应用。以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实验例为抗肿瘤活性，但其只是金花葵系列制备物的活性表征之一，并非限定本专利技术物质在其他活性的应用；所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。实验例本专利技术物质抗肿瘤活性(一)实验材料1.肿瘤细胞肝癌细胞株A549，来自中国科学院细胞库。2.药品与试剂胎牛血清(Gibco)；DMEM培养基(高糖，Gibco)；0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco)；DMSO(分析纯，北京化工厂)；MTT(Amresco)；PBS(北京天悦东方基因技术有限公司)；双抗(Gibco)；乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；不同核苷类成分含量的金花葵系列制备物(自制)。3.仪器设备洁净工作台(北京王堂蓝翼科技有限公司)；L3660D型低速离心机(上海知信实验仪器技术有限公司)；恒温培养箱(ThermoScientific)；立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；XA105DualRange分析天平(MettlerToledo)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HHS型电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；SK-L180-E型摇床(美国SCILOGEX)；MultiskanGO型全波长酶标仪(ThermoScientific)。(二)实验方法与结果1.完全培养基的制备及铺板DMEM完全培养液：精密量取10mL胎牛血清和1mL双抗加入到89mL的DMEM培养基中，即得100mLDMEM完全培养基。铺板：将肿瘤细胞培养在DMEM完全培养液中，置37℃、饱和湿度、5％CO2的培养箱中，隔日换液，待细胞进入对数生长期后，弃去上清液，PBS溶液冲洗2遍，用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，用PBS溶液冲洗2遍。用DMEM完全培养液调整浓度为3.5×104个/mL细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃、饱和湿度、5％二氧化碳恒温培养箱中培养24h；用DMEM完全培养液调整浓度为1×105个/mL细胞悬液接种于12孔板，每孔500μL，置于37℃、饱和湿度、5％二氧化碳恒温培养箱中培养24h。2.药液的制备分别精密称取金花葵各系列制备物25mg溶于5mLDMEM完全培养基中完全溶解，配制成5mg/mL的母液。通过母液逐级稀释，得到浓度分别为1500μg/mL、1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL的药液。精密称取金花葵系列制备物5mg溶于5mLDMEM完全培养基中完全溶解，配制成1mg/mL的母液。通过母液逐级稀释，得到浓度分别为200μg/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
不同核苷类成分含量的金花葵系列制备物(包括提取物、醇沉物、富集物和纯化物等)，其特征在于各制备物主要由如下方法制成：步骤1：选取本专利技术各制备物，可通过含有类似物质的植物及其代用品，包括其植物各个部位，单独或组合制成。如下组，但不限于：组1金花葵(菜芙蓉、野芙蓉、黏干、山榆皮)同属植物原植物(包括金花葵的各部位)、加工品、制备物。步骤2：提取；步骤3：醇沉除杂；步骤4：大孔吸附树脂富集；步骤5：萃取纯化。

【技术特征摘要】
1.不同核苷类成分含量的金花葵系列制备物(包括提取物、醇沉物、富集物和纯化物等)，其特征在于各制备物主要由如下方法制成：步骤1：选取本发明各制备物，可通过含有类似物质的植物及其代用品，包括其植物各个部位，单独或组合制成。如下组，但不限于：组1金花葵(菜芙蓉、野芙蓉、黏干、山榆皮)同属植物原植物(包括金花葵的各部位)、加工品、制备物。步骤2：提取；步骤3：醇沉除杂；步骤4：大孔吸附树脂富集；步骤5：萃取纯化。2.如权利要求1所述的不同核苷类成分含量的金花葵系列制备物，其特征在于步骤1中原料的组成为：金花葵花。3.如权利要求1或2所述的制备物，其特征在于步骤2中，将原料用水或乙醇等溶剂回流提取1-5次，每次提取10～90min，减压回收溶剂至干，制得金花葵提取物。如权利要求1或2所述的制备物，其特征在于步骤2和3中，将金花葵提取物加水分散，调节溶液浓度(以生药量计)为0.05～1.5kg/L，加入1～8倍量的95％乙醇，充分搅拌，静置过夜，2000～8000r/min离心5～30min，取上清液，减压回收溶剂至干，制得金花葵醇沉物。如权利要求1或2所述的制备物，其特征在于步骤4中，使水溶液浓度为0.01～0.80kg/L，水溶液通过弱极性或非极性大孔吸附树脂，吸附流速为0.2～10BV/h，树脂柱径高比为1∶(2～15)，上样量与树脂体积比为0.01～0.50kg/L，水洗脱0-8BV，洗脱流速为0.2～10BV/h，0％-50％乙醇洗脱1-30BV，洗脱流速为0.2～10BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即得金花葵富集物。如权利要求1或2所述的制备物，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：石任兵，孔静，姜艳艳，
申请(专利权)人：石任兵，
类型：发明
国别省市：北京,11