一种检测TNF-α的光电免疫传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测TNF‑α的光电免疫传感器及其制备方法和应用，光基底电极表面依次经GO‑PTC‑NH2溶液、anti‑TNF‑α溶液修饰，所述基底电极为玻碳电极或氧化铟锡半导体电极。本发明专利技术利用GO‑PTC‑NH2纳米复合物制备光电免疫生物传感器用于肿瘤标志物检测的方法，与传统的酶联免疫吸附以及PCR等方法相比具有操作简便、技术要求低、反应迅速的特点，所使用的光电探针摒弃了传统金属材料等的光腐蚀等弊端，稳定性较好且负载量大，功能化基团多，便于修饰。

A detection of TNF alpha photoelectrochemical immunosensor and its preparation method and Application

The invention discloses a method for detection of TNF alpha optoelectronic immunosensor and its preparation method and the application of optical surface of the base electrode by using GO PTC NH2 solution, anti TNF alpha solution modification, the substrate electrode for glassy carbon electrode or indium tin oxide semiconductor electrode. The present invention by photoelectric biosensor method for tumor marker detection using GO PTC NH2 nanocomposite, compared with the traditional ELISA and PCR method has the advantages of simple operation, low technical requirements, rapid response characteristics of the photoelectric probe used to abandon the drawbacks of the traditional metal light corrosion etc. material, good stability and load capacity, functional groups, easy to modify.

【技术实现步骤摘要】
一种检测TNF-α的光电免疫传感器及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及一种检测TNF-α的光电免疫传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤标志物是在癌症患者的肿瘤或血液、尿液等其他体液中可以检测到的分子变化，检测其含量变化可以作为对疾病的诊断和预后指标，用于疗效观察及监测有无复发。现在的酶联免疫法等临床分析技术大都只能检测到较明显的变化导致疾病很少能够在早期发现并且进行干预治疗，因此找到更为灵敏与特异的检测微量抗原的方法与平台就显得尤为重要。光电化学传感器依据光被半导体电极、金属材料或电极周围溶液中的反应剂吸收后体现出的光能与电能和化学能的转换，在生命分析领域具有强大的应用前景，并且其灵敏度高、检测限低、成本低、反应快、特异性强，有望实现肿瘤等疾病早期检测与诊断。羧基化石墨烯(GO)是将氧化石墨烯分子环氧基活化成羧基加以利用的碳功能化材料，通过引入更多极性基团羧基解决了石墨烯本身由于高表面积而容易团聚的问题，同时也增强了该材料的可修饰性，使其不仅可以凭借强大的π-π共轭与材料复合同时也可以依靠羧基化基团与其他生物分子共价结合，并且具有良好的生物相容性，成为传感器构建中候选材料之一。氨基化苝四羧酸PTC-NH2作为3,4,9,10-苝四羧酸二酐(PTCDA)的氨基化产物，具有氨基和共轭芳烃结构，同时也有优异的电子传输与光电响应特性，可以作为增强光电信号的核心材料。基于多羧基化氧化石墨烯GO与氨基化苝四羧酸PTC-NH2复合物为光电探针(GO-PTC-NH2)，利用了碳纳米材料氧化石墨烯GO的高比表面积和羧基化官能团以及PTC-NH2材料的优异光电转化性质、氨基化官能团的优势，形成一个具有较强光电转化效率的光电探针。两者之间通过强烈的π-π共轭以及静电相互作用紧密嵌合，使得GO片层负载大量的PTC-NH2分子，其中前者提供羧基以及作为载体负载更多的信号材料和识别分子，后者提供氨基且嵌入氧化石墨烯片层中增强导电性及提供光电活性。凭借该纳米信号复合物自然光下的优异光电活性进行光电信号转导，用作传感器基底材料实现对后续分子的检测。肿瘤坏死因子-alpha(TNF-α)能杀伤和抑制肿瘤细胞，抗感染，并参与某些自身免疫病的病理损伤。该痕量物质含量的细微变化对于疾病的早期诊断、药物疗效评定或者健康状况评估都有一定的指导作用。因此本体系所构建传感器被首先用于TNF-α光电化学检测，该过程中通过光电流变化评价靶标物浓度的依据主要是空间位阻与绝缘大分子对于电解液与电极表面进行电子传递能力的削弱影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用羧基化氧化石墨烯(GO)以及氨基化苝四羧酸(PTC-NH2)复合物制备光电免疫生物传感器用于肿瘤标志物检测的方法。即首先通过强烈的π-π共轭以及静电相互作用使得大量PTC-NH2分子紧密嵌合负载在GO片层表面，形成一个导电性良好且具有优异光电活性的纳米信号复合物；之后将该光电探针用作传感器基底材料进而负载锚定大量的anti-TNF-α识别分子构成捕获层；最后凭借抗原抗体之间特异的识别，检测待测液中靶标物TNF-α的含量。此方法的优点在于采用光电化学免疫传感增强了灵敏度，同时使用无机碳纳米材料与有机分子结合构成的探针，增强了生物相容性，性质稳定且反应位点充足。利用该方式制备的光电免疫传感器操作简便，反应迅速，灵敏度高，能够实现对于痕量抗原的检测，为开发出性能更优异的光电探针以及平台用于临床诊断提供思路。本专利技术中技术术语的缩写如下：羧基化氧化石墨烯：GO；氨基化苝四羧酸：PTC-NH2；TNF-α抗体：anti-TNF-α；氧化铟锡半导体电极：ITO；玻碳电极：GCE；苝四羧酸二酐：PTCDA。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种检测TNF-α的光电免疫传感器的制备方法，基底电极表面依次经GO-PTC-NH2溶液、anti-TNF-α溶液修饰。优选地，所述基底电极为玻碳电极或氧化铟锡半导体电极。所述GO-PTC-NH2溶液按如下步骤制备：称取GO和PTC-NH2在1×PBS溶液中溶解，超声分散后将混合溶液在室温反应20～24h，得到GO-PTC-NH2溶液。优选地，GO和PTC-NH2研磨成细粉状，所述GO和PTC-NH2的质量比为1:1。GO和PTC-NH2在PBS溶液中的浓度为0.25mg/ml。所述PTC-NH2按如下步骤制备：将PTCDA溶解于乙醇中，混合均匀，逐滴加入乙二胺，室温搅拌反应24h，离心，将沉淀分别用无水乙醇、超纯水清洗至滤液无色，烘干燥后得到PTC-NH2。所述PTCDA和乙二胺的比例为1g：10ml；PTCDA和乙醇的比例为1g：5ml。更优选地，所述PTC-NH2按如下步骤制备：称取0.5gPTCDA溶解于2.5ml乙醇，此时红色溶液，室温600rpm磁力搅拌1h后向其缓慢逐滴加入乙二胺试剂5ml，可观察到溶液变成紫色，继续搅拌反应24h。将所得溶液离心之后取沉淀，分别用无水乙醇、超纯水清洗三次至滤液基本无色，期间以超声方式溶解沉淀。清洗完成后将沉淀置于烘箱37℃干燥2天，所得紫黑色固体即为PTC-NH2，将其转移至试剂瓶遮光保存于干燥器中待用。一种检测TNF-α的光电免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)基底电极预处理；(2)将GO-PTC-NH2溶液滴加到步骤(1)得到的电极表面，室温放置20～24h，用去离子水清洗，晾干；(3)向步骤(2)得到的电极表面滴加戊二醛溶液，然后用去离子水清洗，清洗后将Anti-TNF-α溶液滴加到基底电极上进行孵育，然后用体积分数为0.05％PBST溶液清洗，晾干；(4)向步骤(3)得到的电极表面滴加BSA溶液和PEG20000溶液，室温封闭30min，用体积分数为0.05％PBST溶液清洗，晾干。所述步骤(1)中ITO电极置于无水乙醇以及50％异丙醇分别超声清洗两次，每次15min。超声过程中保证整个电极每个面自始至终都处于处理液中，防止电极之间吸附。所述步骤(1)中GCE电极用0.3μm的Al2O3浆抛光，依次置于无水乙醇、去离子水中超声清洗最后用去离子水冲洗。所述步骤(2)中GO-PTC-NH2溶液的浓度为0.25mg/ml，是以溶液中GO的浓度计算。GO-PTC-NH2溶液是过量的，未结合的用去离子水清洗。所述步骤(3)中戊二醛溶液中溶剂为去离子水，戊二醛浓度为25mg/ml；Anti-TNF-α溶液中溶剂为1×PBS缓冲液，Anti-TNF-α的浓度为1μg/ml；PBST溶液的溶剂为1×PBS缓冲液。戊二醛溶液和Anti-TNF-α溶液是过量的。优选地，所述步骤(3)中孵育温度为4℃，孵育时间为12h。所述步骤(4)中BSA溶液的溶剂为1×PBS缓冲液，BSA浓度为10mg/ml；PEG20000溶液的溶剂为去离子水，PEG20000的浓度为50mg/ml。BSA溶液和PEG20000溶液是过量的。上述任一一种制备方法制备得到的光电免疫传感器。上述光电免疫传感器在定量检测TNF-α中的应用。有益效果：本专利技术利用氧化石墨烯以及氨基化苝四羧酸纳米复合物制备光电免疫生物传感器用于肿瘤标志物检测的方法，与传统的酶联免疫吸附以及PCR等方法相比具有操作简便、技术要求低、反应迅速的特点，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测TNF‑α的光电免疫传感器的制备方法，其特征在于，基底电极表面依次经GO‑PTC‑NH2溶液、anti‑TNF‑α溶液修饰。

【技术特征摘要】
1.一种检测TNF-α的光电免疫传感器的制备方法，其特征在于，基底电极表面依次经GO-PTC-NH2溶液、anti-TNF-α溶液修饰。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基底电极为玻碳电极或氧化铟锡半导体电极。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述GO-PTC-NH2溶液按如下步骤制备：称取GO和PTC-NH2在PBS溶液中溶解，混合均匀后将混合溶液在室温反应20～24h，得到GO-PTC-NH2溶液。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述GO和PTC-NH2的质量比为1:1。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述PTC-NH2按如下步骤制备：将PTCDA溶解于乙醇中，混合均匀，逐滴加入乙二胺，室温搅拌反应24h，离心，将沉淀分别用乙醇、水清洗至滤液无色，干燥后得到PTC-NH2。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈艳飞，胡慧祯，潘登，张明明，张袁健，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32