用于单细胞遗传分析的系统和方法技术方案

本发明专利技术提供了用于并行分析单细胞的核酸的方法和系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于单细胞遗传分析的系统和方法专利
本专利技术涉及用于分子诊断的试剂盒和方法。具体地但非排他地，本专利技术涉及可用于单细胞的遗传分析的方法和系统。专利技术背景在许多生物医学应用中，表征细胞中的RNA群体是重要的。这在许多研究应用和临床诊断中是有用的。生物组织和生物体的某些数量遗传分析最好在单细胞水平进行。然而，单细胞仅包含皮克的遗传物质。已经引入了分子方案，以通过对个体细胞的RNA进行测序来揭示转录物组。显微术、荧光激活细胞分选(fluorescence-activatedcellsorting；FACS)或基于实时PCR的方法可以提供单细胞角度的实验，但一次仅能够测定少数基因。高通量技术诸如微阵列和RNA-Seq提供所有基因表达的全视图，但需要比在单细胞中发现的遗传物质更多的遗传物质，并且通常用数千到数百万个细胞进行。这些技术在细胞群体水平提供有用的遗传信息，但对于在单细胞水平上理解生物学具有严重的限制。最近，一种称为CEL-Seq方案的方法被开发用于克服少的起始量的RNA的限制(Hashimshony等，2012,CellReports2，第666–673页)。该方法利用了将样品加条形码并将其汇集，然后通过使用一轮体外转录线性扩增mRNA。所描述的方法比基于PCR的扩增方法显示出更加可重复的、线性的且灵敏的结果。通过该方法能够实现的稳健的转录物组定量也被证明可用于包含不同细胞类型群体的复杂组织的转录物组分析。为了鉴定转录物组，已经引入了几种放大(scaleup)方法。当前的生物工具还缺乏在许多单细胞中并行进行遗传测量的能力。常规单细胞技术是缓慢的、冗长的，并且限制了可以一次性分析的细胞数量。微流体技术已经用于使过程自动化，达到每次运行近似100个细胞，每一次都非常昂贵。机器人技术也已经被开发，以将该过程放大至1000个细胞的数量级。然而，这两种方法都牵涉购买昂贵的机器和部件，并且在这两种技术中，过程都是耗时且不直接的。美国专利申请第2014/0066318号描述了用于组织样品中核酸的定位或空间检测的方法和产品。国际专利申请第WO2013/180567号、第WO2007/022026号、第WO2010/142954号、第WO2013/188872号、第WO2014/201273号及美国专利申请第US2011/0111981号涉及单细胞分离和/或分析。国际专利申请第WO2015/118551号提供了用于将细胞从液体介质分离并进行细胞术分析的设备和方法。WO2015/118551的内容通过引用以其整体并入本文。对用于进行单细胞的大规模并行核酸分析(例如，转录物组分析)的改进的方法和系统存在需求。专利技术概述根据一个方面，提供了一种用于并行分析单细胞的核酸的方法，所述方法包括：(a)将包含待被分析的细胞悬浮液的液体介质接收到细胞储存器中；(b)从通过细胞笼(cage)阵列与所述细胞储存器分开的封闭式储存器抽吸所述液体介质，直至分离的单细胞进入到所述细胞笼阵列的每一个细胞笼中，从而将单细胞分离在细胞笼中以产生分离的细胞；(c)提供微阵列，所述微阵列包含多个DNA斑点，其中每一个DNA斑点包含对所述DNA斑点独特的探针和核酸条形码；(d)将所述细胞笼阵列安装在所述微阵列上；(e)向所述细胞笼阵列提供裂解缓冲液以及适于核酸合成和扩增的缓冲液和条件，从而产生扩增的核酸分子的文库；以及(f)将所述扩增的核酸分子的文库测序，并且根据所述核酸条形码确定所测序的核酸分子的细胞来源。根据另一个方面，提供了一种系统，所述系统包括：i.微阵列，所述微阵列包含多个DNA斑点，每一个DNA斑点包含对所述斑点独特的探针和核酸条形码，所述探针包含聚胸腺嘧啶区域；以及ii.设备，所述设备被配置为将细胞从液体介质分离，所述设备包括：(a)细胞储存器；(b)封闭式储存器；(c)细胞笼阵列，所述细胞笼阵列在所述细胞储存器与所述封闭式储存器之间，每一个细胞笼包括与所述第一细胞储存器相邻的大开口、细胞笼和与所述封闭式储存器相邻的至少一个小开口；(d)液体介质泵，所述液体介质泵被连接至所述封闭式储存器，所述泵被配置为通过使所述液体介质从所述细胞储存器流动通过所述细胞笼阵列到达所述封闭式储存器而使得所述悬浮的细胞移动进入到细胞笼中；以及(e)机械元件，所述机械元件当被致动时将所述细胞笼阵列推向所述微阵列，从而所述微阵列形成针对所述大开口的连续屏障，将每一个细胞分离在所述细胞笼的每一个中。提供该概述，以便以简化的形式介绍概念的选择，这些概念在下文的详述中被进一步描述。该概述既不意图识别所要求保护的主题的关键特征或基本特征，其也不意图被用于限制所要求保护的主题的范围。附图简述图1A-H阐释了作为本专利技术的一个实施方案的用于并行分析单细胞RNA表达的方法。(1A).具有微孔的膜被用于捕获隔离室(isolatedchamber)中的个体细胞(1B)。然后将具有细胞的膜安装到具有成千上万个DNA斑点的DNA微阵列上：每一个斑点包含约一百万个DNA分子，其全部具有相同核苷酸序列(1C)。每一个斑点包含该序列的不同变体，并且充当分子条形码。将凝胶添加至膜(1D)，并且添加溶液以裂解细胞(1E)；该凝胶起到防止RNA从笼中漏出的作用。在一个实施方案中，然后在微阵列上进行RNA-Seq方案(逆转录(RT)、第二链合成(SSS)和体外转录(IVT))，产生游离的扩增的RNA(1F-H)。专利技术详述定义除非另有说明，在讨论中，修饰词诸如修饰本专利技术的实施方案的一个特征或更多个特征的条件或关系特征的“基本上”和“约”被理解为意指将条件或特征定义为在对于其意图用于的应用的实施方案的操作可接受的公差内。除非另有指示，说明书和权利要求中的词“或”被认为是包括性的“或”而不是排除性的或，并且指示它所连接的项目的至少一个或任何组合。在本申请的说明书和权利要求中，动词“包括(comprise)”、“包括(include)”和“具有(have)”中的每一个及其词形变化(conjugates)，用于指示动词的一个宾语或更多个宾语不必然是动词的一个主语或更多个主语的组分、要素或部件的完整列表。如本文使用的，“单细胞(singlecell)”指一个细胞。术语“分离的单细胞”指从其他组分(例如，细胞或细胞碎片，包括但不限于膜、蛋白或核酸分子)完全、基本上或部分分开、分离、排除出(excluded)或纯化的单细胞。术语“细胞”指活的生物体的功能基本单位。来自任何群体的悬浮的细胞可以被用于所描述的方法和/或系统；实例包括但不限于哺乳动物细胞、哺乳动物单核血细胞、原核细胞、植物细胞、真核单细胞生物体包括细菌或酵母、或其组合。可以以本领域熟知的几种方式从组织获得悬浮的细胞。细胞可以容易地从血液纯化；单核细胞可以通过用分解细胞外基质的酶诸如胶原酶、胰蛋白酶或链霉蛋白酶进行酶促消化从软组织释放。可选地，可以将组织块(piecesoftissue)置于生长介质中，并且生长出的细胞可用于培养。如本文使用的，术语“分开(separating)”、“排除出(excluding)”或“分离(isolating)”意图意指物质已经从其他组分(例如，细胞或细胞碎片包括但不限于膜、蛋白或核酸分子)完全、基本上或部分分开、分离、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于并行分析单细胞的核酸的方法，所述方法包括：(a)将包含待被分析的细胞悬浮液的液体介质接收到细胞储存器中；(b)从通过细胞笼阵列与所述细胞储存器分开的封闭式储存器抽吸所述液体介质，直至分离的单细胞进入到所述细胞笼阵列的每一个细胞笼中，从而将单细胞分离在细胞笼中以产生分离的单细胞；(c)提供微阵列，所述微阵列包含多个DNA斑点，其中每一个DNA斑点包含对所述DNA斑点独特的探针和核酸条形码；(d)将所述细胞笼阵列安装在所述微阵列上；(e)向所述细胞笼阵列提供裂解缓冲液以及适于核酸合成和扩增的缓冲液和条件，从而产生扩增的核酸分子的文库；以及(f)将所述扩增的核酸分子的文库测序，并且根据所述核酸条形码确定所测序的核酸分子的细胞来源。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.05 GB 1501907.81.一种用于并行分析单细胞的核酸的方法，所述方法包括：(a)将包含待被分析的细胞悬浮液的液体介质接收到细胞储存器中；(b)从通过细胞笼阵列与所述细胞储存器分开的封闭式储存器抽吸所述液体介质，直至分离的单细胞进入到所述细胞笼阵列的每一个细胞笼中，从而将单细胞分离在细胞笼中以产生分离的单细胞；(c)提供微阵列，所述微阵列包含多个DNA斑点，其中每一个DNA斑点包含对所述DNA斑点独特的探针和核酸条形码；(d)将所述细胞笼阵列安装在所述微阵列上；(e)向所述细胞笼阵列提供裂解缓冲液以及适于核酸合成和扩增的缓冲液和条件，从而产生扩增的核酸分子的文库；以及(f)将所述扩增的核酸分子的文库测序，并且根据所述核酸条形码确定所测序的核酸分子的细胞来源。2.如权利要求1所述的方法，其中所述分析为至少部分转录物组分析。3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)包括将凝胶垫安装在所述细胞笼阵列上，所述凝胶垫包含选自裂解缓冲液和适于核酸扩增的缓冲液的至少一种缓冲液。4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)的所述条件以相继的方式包括：(i)RT反应；(ii)第二链合成反应，以及(iii)扩增反应，从而提供扩增的RNA的文库。5.如权利要求4所述的方法，其中所述第二链合成选自DNA聚合酶反应、基于PCR的扩增和滚环扩增。6.如权利要求4所述的方法，其中所述第二链合成包括使用DNA聚合酶1和RNA酶H。7.如权利要求1所述的方法，其中所述探针包含聚胸腺嘧啶区域。8.如权利要求1所述的方法，其中所述探针包含启动子。9.如权利要求7所述的方法，其中所述启动子为T7启动子。10.如权利要求1所述的方法，其中所述并行分析为约105至106个细胞。11.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞悬浮液包含约105至106个细胞。12.如权利要求1所述的方法，其中所述裂解缓冲液为包含去垢剂的低渗缓冲液。13.一种系统，所述系统包括：i.微阵列，所述微阵列包含多个DNA斑点，每一个DNA斑点包含对所述DNA斑点独特的探针和核酸条形码；以及ii.设备，所述设备被配置为将细胞从液体介质分离，所述设备包括：(a)细胞储存器；(b)封闭式储存器；(c)细胞笼阵列，所述细胞笼阵列在所述细胞储存器与所述封闭式储存器之间，...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊泰·亚纳伊，U·西万，E·布罗德，塔马·哈施姆索尼，阿纳托利·森德罗威驰，
申请(专利权)人：技术研究及发展基金有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列,IL